Sanger测序法检测ARMS-PCR法漏检的EGFR基因

英文标题：Detection of Rare Mutations in  EGFR-ARMS-PCR-Negative LungAdenocarcinoma  by Sanger Sequencing

单位及作者：广州呼吸疾病研究所和广州医科大学第一附属医院张洁霞主任团队成员及相关研究人员。

发表期刊：YONSEI MED J

研究背景

肺癌是常见的胸部恶性肿瘤， EGFR基因突变率在高加索人群肺癌患者中为5-10％，在亚洲人非吸烟患者中为60-70%[1]。与标准化疗相比，EGFR敏感突变的NSCLC患者对EGFR抑制剂（包括吉非替尼和厄洛替尼）高度敏感。因此，EGFR突变的准确检测对EGFR突变阳性非小细胞肺癌患者临床管理中起着关键作用。

目前，检测EGFR突变的方法包括Sanger测序，突变扩增系统（ARMS），焦磷酸测序，高分辨率熔解分析和高通量测序。Sanger测序仍然是临床实践中EGFR突变检测的金标准，并且可以检测到未知的EGFR突变。

研究目的

用Sanger测序法检测ARMS-PCR方法未检测到的潜在EGFR基因未知突变。

材料和方法

广州医科大学第一附属医院的200例样本，包括用ARMS方法检测的100例EGFR基因突变阴性样本和100例EGFR突变阳性样本。用Sanger测序进行检测，分析两种方法学和灵敏度以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的结果。

提取：使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒从福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织中提取DNA。 再使用NanoDrop1000分光光度计测量其浓度（ng / mL）和吸光度（A260/ 280比率）后，将基因组DNA保存在-20±5℃。

Sanger测序：使用广州立菲达安诊断产品技术有限公司EGFR突变检测试剂盒进行扩增。 使用ABI 3100遗传分析仪（AppliedBiosystems）进行测序和数据收集。

ARMS qPCR：使用ADx-ARMS EGFR 21检测试剂盒检测常见的EGFR突变。

结果及讨论

1.   在100例ARMS阴性样品中，三例通过Sanger方法检测到突变呈阳性，并且确认了97例阴性样品。

2.   ARMS方法检测为阴性Sanger测序方法检测为阳性的三例样本突变情况为：c.2237_2251>TTC (complex)仅在cosmic的数据库中报道了1次,c.2231_2232ins18 (insertion)在cosmic的数据库中报道了6次, and c.2515G>A (substitution, position 2515, G→A)在数据库中报道了4次。ARMS方法仅可以检测外显子18-21中的29个EGFR突变位点，该方法学因设计缺陷会漏检。Sanger测序法检测位点全面可以检测未知和罕见突变。

3.   在EGFR-TKI治疗方面，Sanger测序或ARMS检测的EGFR阳性患者的中位PFS分别为11.1个月和10.9个月（95％CI，10.7-11.3月），这种差异并不显著。高EGFR突变丰度患者PFS为12.4个月高于EGFR突变丰度低的患者（10.7-11.3月）。接受EGFR-TKIs的c.2237_2251>TTC突变患者或c.2231_2232ins18突变患者的PFS分别为3个月和6个月。EGFR-TKI治疗4个月后，1例c.2515G> A突变患者失访。

在EGFR突变非小细胞肺癌患者中，与EGFR野生型肺癌患者相比，EGFR-TKI治疗显着提高了生存率。EGFR突变位于外显子18〜21，可作为EGFR-TKIs功效的预测因子。 因此，EGFR突变的检测在非小细胞肺癌患者管理中起着关键作用。目前两种主要的检测方法是ARMS和Sanger测序。Sanger测序是金标准， ARMS仅限于检测已知的突变。每个反应系统只能检测到预先指定的基因突变。因此，如果必须分析未知区域，则需要大量样本和重新设计引物对，使得该方法昂贵。Sanger测序可以以相对较低的成本分析未知的DNA序列。

研究结果表明，Sanger测序可推荐用于EGFR重新检测和手术标本的初步检测。我们确定EGFR-TKI治疗后具有高EGFR突变丰度的患者具有更好的结果。根据以前的报道，EGFR突变丰度可以预测晚期NSCLC EGFR-TKI治疗的结果。 因此，在临床实践中，Sanger测序为医师提供了额外的信息，以预测患者是否可以从EGFR-TKI获益。

     Sanger测序可以检测罕见的EGFR突变，并且适用于重新确定EGFR突变情况。 具有高突变丰度的NSCLC患者对EGFR-TKI治疗具有更好的效果。 需要更多临床试验来评估EGFR-TKIs在罕见EGFR突变患者中的疗效。

原文链接：https://doi.org/10.3349/ymj.2018.59.1.13

部分参考文献：

1.    Tan DS, Mok TS, Rebbeck TR. Cancer genomics: diversity and disparity across ethnicity and geography. J Clin Oncol 2016;34:91–101    

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