PROTAC：有望解决BTKi耐药问题的新技术

       慢性淋巴细胞白血病（CLL）的特征是在次级淋巴器官（淋巴结，脾脏）、骨髓和外周血中逐渐积累成熟的单克隆的B淋巴细胞。通过B细胞受体（BCR）的信号传导是CLL的核心，布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是BCR信号传导途径的重要组成部分，CLL细胞的增殖和生存依赖于BTK的持续活化（1）。小分子的BTK抑制剂（BTKi）通过与BTK结合来阻断BCR信号级联，从而抑制CLL细胞的增殖，在临床上取得了显著的效果，目前已经成为CLL的标准治疗药物，并且在其它一些B细胞非霍奇金淋巴瘤例如套细胞淋巴瘤（MCL）、华氏巨球蛋白血症（WM）中也得到较多的应用。

       第一代的BTKi伊布替尼通过与BTK活性位点的半胱氨酸残基（C481）形成共价键，从而抑制BTK的活性，起到治疗CLL的作用。CLL对伊布替尼最常见的耐药机制是C481结合位点的突变，其中最常见的是C481S的突变，即半胱氨酸（C）残基突变为丝氨酸（S），这样一来伊布替尼与BTK结合能力下降，因而降低了对BTK的抑制作用。根据法国的一项临床研究，在持续治疗至少3年后仍使用伊布替尼且CLL细胞>0.5´109/L的CLL队列中，在57%的患者样本中检测到BTK的突变，检测后中位随访8.5个月，发现BTK突变与疾病进展显著相关（2）。

       第二代的BTKi，例如阿卡替尼和泽布替尼等，在设计上提高了靶点选择性和对BTK的占有率，在一定程度上降低了脱靶效应，进而提高了用药安全性，但是它们与BTK结合的位点与伊布替尼是完全相同的，因此BTK结合位点突变也同样是二代BTKi耐药的主要机制。

       为了解决这个问题，开发了第三代的非共价可逆结合的BTKi，有些已进入了临床试验阶段。这类BTKi既可以与BTK野生型结合，也可以与BTK突变型结合，因此有望克服的由BTK结合位点的突变所引起的耐药（3）。今年2月24日新格兰医学杂志报道第三代BTKi也通过BTK突变等机制导致耐药（4）。

但是，还有没有其它或者说更好的办法来解决BTKi耐药的问题呢？

       一项全新的并且已经成为全球研究热点的新技术，有望在这方面带来突破性的进展，这就是PROTAC技术。

       PROTAC的全称是Proteolysis-Targeting Chimeras，即“靶向蛋白降解嵌合体”，又称为Compound Degradation Activating Chimeras (CDACs), 即嵌合式降解激活化合物。PROTAC分子由三部分构成：一是靶向目标蛋白的配体，二是E3泛素连接酶配体，三是连接上述结构的连接器。PROTAC分子可在细胞内诱导目标蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别并降解。具体说就是，PROTAC分子的一端可与靶蛋白结合，另一端可与E3泛素连接酶结合。E3泛素连接酶将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白，之后，蛋白酶体会降解被标记的靶蛋白，从而实现让靶蛋白完全失活的作用（图一）。PROTAC分子在靶蛋白降解后会被重新释放进入下一次招募E3、标签目标蛋白的过程。

图一：PROTAC的原理

      泛素蛋白酶体途径（Ubiquitin-proteasome Pathway），是所有真核生物体内最重要的蛋白质降解途径，有关研究于2004年获得了诺贝尔化学奖。PROTAC靶向技术，巧妙的利用了泛素蛋白酶体途径介导的蛋白降解这个机体用来调节细胞内蛋白水平与功能的重要机制，是一项突破性的发明。与传统的小分子抑制剂相比，基于PROTAC技术的蛋白降解剂有一些独特的优势。其中，最大的优势是将原本“不可成药性”（  （undruggable）的靶点变成“可成药性”（druggable）的靶点。大多数小分子药物需要结合酶的活性位点来发挥作用，然而，在肿瘤的有限开发靶点中，仅大约1/3为具备酶活性的靶点，绝大多数无酶活性靶点不具备小分子抑制剂成药性(5)。PROTAC只需要与目标蛋白弱结合就可以特异性地“标记”它，然后通过蛋白酶体途径将其降解。此外，PROTAC还有望通过这种独特的机制来解决传统蛋白抑制剂的耐药性问题。

      根据清华大学饶燏教授团队所进行的研究（6），在体外试验中基于PROTAC的BTK蛋白降解剂能够靶向降解C481S突变的BTK蛋白，从而克服该突变带来的对伊布替尼的耐药。该团队后来又发表了体内实验的结果（7），研究显示，利用PROTAC技术可降解多个突变型BTK蛋白，因此可应用于对伊布替尼耐药的CLL和B细胞非霍奇金淋巴瘤。

       基于相关研究，目前在中国有两款正在早期临床试验阶段的BTK降解剂，海思科医药开发的HSK29116, 和百济神州开发的BGB-16673。这两款药物均可一方面通过特异性结合BTK直接抑制BTK活性，另一方面能诱导 BTK 泛素化标记，通过蛋白酶体途径将其降解，从而阻断BCR信号通路的传递，抑制B细胞淋巴瘤细胞的增殖，起到双重抗肿瘤作用。

       目前，HSK29116是全球首个申报临床的口服BTK-PROTAC小分子抗肿瘤药物，I期临床试验已经获得国家药品监督管理局批件，已在江苏省人民医院在内的4家研究中心正式启动，在澳大利亚和美国的临床试验申请也同步进行中。

       临床前研究的结果显示，与第一代BTKi相比，HSK29116具有更好的靶点选择性（图二），并且基于其独特的作用机制，可以克服C481S突变所带来的耐药性（图三）。如果在即将开展的临床试验中证实了安全性和有效性，将有望为CLL以及套细胞淋巴瘤等B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者带来福音。

图二：HSK29116与伊布替尼的靶点选择性比较

       如上图所示，HSK29116对BTK的抑制作用大于伊布替尼，而对EGFR，ITK和TEC等激酶的抑制作用则远低于伊布替尼，因此更加具有选择性。靶点选择性跟安全性有一定的关系，高选择性一般会有潜在的安全性优势。

图三：HSK29116对BTK C481S蛋白的降解作用

       百济神州自主研发的BTK蛋白降解剂（又名BTK-CDAC），BGB-16673已完成在中国，澳大利亚和美国的临床试验申请，正在全球同步开展I期临床试验。

       BGB-16673是一款强效、高选择性、口服给药的靶向BTK的蛋白降解剂。细胞试验，证实BGB-16673可与野生型（WT）BTK和对第一代、第二代BTKi耐药突变BTK有效结合（e.g. C481S, L528W），抑制细胞增殖，降解BTK蛋白。临床前试验还通过比较其对激酶类，非激酶类靶点抑制率，证明了BGB-16673对于BTK靶点的高选择性。

       如果打一个比方来形容BTK-PROTAC与第一代和第二代BTKi有什么不同的话，可以把BTK想象成是一个无恶不作的坏蛋，先前的BTKi，即小分子的BTK抑制剂所作的事情是把BTK抓起来并关进监狱，这样BTK就无法再做恶了。但是，BTK与其它所有的坏蛋一样是非常狡猾的，可以通过突变来实现“越狱”。而BTK-PROTAC所作的事情是先把BTK抓起来，然后将其标记为死刑犯，接下去就枪毙了。这样，没有了BTK，哪里还有什么越狱？而且，即使BTK发生了突变也是徒劳的，BTK-PROTAC仍然能识别出这个坏蛋，抓起来并枪毙，这种解决问题的方式，显然是更彻底。当然，BTK-PROTAC是否能够完美的做到这一点并且没有增加额外的或者说意想不到的副作用，还有待临床试验的观察。

       目前，全球尚无已上市的PROTAC小分子抗肿瘤药物，HSK29116正在开展的临床研究是一项单臂、开放、多中心、两阶段的1a/1b期研究，旨在考查HSK29116的安全性、药动学/药效学和初步有效性特征。百济神州正在中国与全球同步进行一项评价BTK靶向蛋白降解剂BGB-16673用于治疗B细胞恶性肿瘤患者的1期、开放性、剂量探索研究。如果BTK降解剂能够成功开发上市，不仅为复发或难治性的B细胞恶性肿瘤提供了可及的有效药物，而且也是中国医药研发企业在这个领域的又一贡献，并可借助BTK蛋白降解剂的开发经验，目标更多肿瘤治疗靶点进行PROTAC药物开发，具有重要的临床价值和社会意义。

参考文献

（1） Smith CI. From Identification of the BTK Kinase to Effective Management of Leukemia. Oncogene.2017;36(15):2045–2053.

（2） Quinquenel A, Fornecker LM, Letestu R, et al. French Innovative Leukemia Organization (FILO) CLL Group. Prevalence of BTK and PLCG2 mutations in a real-life CLL cohort still on ibrutinib after 3 years: a FILO group study. Blood. 2019;134(7):641-644.

（3） Michot JM, Ribrag V. Pirtobrutinib shows evidence to inaugurate a third generation of BTK inhibitors. Lancet. 2021;397(10277):855-857.

（4） Wang E, Mi X, Thompson MC, et al. Mechanisms of Resistance to Noncovalent  Bruton’s Tyrosine Kinase Inhibitors. N Engl J Med, 2022,386(8):735-743.

（5） Behan FM, Iorio F, Picco G, et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 2019; 568(7753):511–516.

（6） Sun Y, Zhao X, Ding N, et al. PROTAC-induced BTK degradation as a novel therapy for mutated BTK C481S induced ibrutinib-resistant B-cell malignancies. Cell Res. 2018;28(7):779–781.

（7） Sun Y, Ding N, Song Y, et al. Degradation of Bruton’s tyrosine kinase mutants by PROTACs for potential treatment of ibrutinib-resistant non-Hodgkin lymphomas. Leukemia. 2019; 33(8):2105–2110.

专栏作者 | 橙色雨丝

审稿专家 | 南京医科大学第一附属医院血液科主任 李建勇教授