科研 | Nutrients：缺乏运动是否会引起人体肠道菌群的显著变化？来自干浸低活性模型的新答案

编译：微科盟如风，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

肠道微生物群是人类健康的主要贡献者，它受身体活动和饮食的影响，并与骨骼肌表现出功能性的交互作用。相反，尽管久坐的生活方式很普遍，并且与健康和社会经济的负面影响有关，但很少有关于活动不足的影响的数据。本研究的目的是确定干浸法（DI）（一种严重活动不足的模型）对人类肠道微生物群组成产生的影响。在严格控制饮食的条件下，我们收集了14名健康男性的粪便样本，通过16S宏基因组测序确定肠道微生物群的分类概况。结果发现，α和β多样性指数基本没有变化。然而，属于厚壁菌门的梭状芽孢杆菌目Clostridiales和毛螺菌科Lachnospiraceae的操作分类单元（OTU）在DI后显著增加。在DI后的粪便样本中，可以观察到由骨骼肌代谢的短链脂肪酸——丙酸明显减少。肠道细菌对活动不足很敏感，这一发现引发了人们对肠道菌群在长期久坐生活方式中的影响和作用的关注。

论文ID

原名：Does Physical Inactivity Induce Significant Changes in Human Gut Microbiota? New Answers Using the Dry Immersion Hypoactivity Model

译名：缺乏运动是否会引起人体肠道菌群的显著变化？来自干浸低活性模型的新答案

期刊：Nutrients

IF：5.717

发表时间：2021.10.29

通讯作者：Christelle Koechlin-Ramonatxo

通讯作者单位：法国蒙彼利埃大学

DOI号：10.3390/nu13113865

实验设计

实验设计图

 图1 参与者的流程图。招募20名男性接受为期5天的干浸实验。在随机化之前，两名参与者被排除在外。剩下的18名男性被分为两组：对照组（n=9）和实验组（带大腿袖套；n=9）。在DI-0和DI-5时收集粪便样本进行肠道微生物群分析。DI-0为干浸实验开始前；DI-5 为干浸实验第5天。  

表1 DI 开始前第2天的基线特征 （BDC-2）。  

数据为平均值±SD。BDC = Baseline Data Collection基线数据收集。BMI = Body Mass Index体重指数；VO2max =最大耗氧量；HR = Heart rate心率；T =温度；SPB= Systolic Blood Pressure收缩压；DPB = Diastolic Blood Pressure舒张压；DI = Dry Immersion干浸；CTL = control group （no thigh cuffs） 对照组（无大腿环带）；CUFFS= with thigh cuffs（有大腿环带）；ALL =全部样本。采用非配对t检验检查统计学意义。  

前言

人体肠道内有100 万亿个细菌，被称为肠道微生物群。这些丰富多样的细菌群落与宿主共生，在人类健康中发挥着关键作用。肠道菌群组成受多种因素影响，如出生方式、生活环境、饮食和抗生素摄入等。一些研究也描述了与身体活动和能量消耗的联系，最近的综述强调了体力活动与肠道微生物群之间的相互作用。例如，运动员表现出特定的肠道微生物群组成。然而，除了剧烈的体育活动外，运动员的饮食摄入模式与久坐的受试者不同，这也可能影响他们的肠道微生物群组成。然而，在健康久坐或患病人群（与年龄相关的病理、胃肠道疾病、代谢或炎症性疾病如肥胖或骨关节炎……）中进行不同训练方式的干预研究支持运动和体育活动对肠道微生物群的有益影响。

肠道微生物群作为免疫系统的调节器，有助于肠道稳态和肠道完整性（渗透性和炎症），还通过产生维生素和短链脂肪酸（SCFAs，用作上皮细胞的燃料）发挥营养作用和调节基因表达）以及脂质代谢和低度炎症的调节。此外，我们的实验室揭示了肠道微生物群和骨骼肌之间的功能性交互作用，骨骼肌是一种在能量平衡调节、体重组成和身体表现方面具有重要作用的组织。具体来说，我们在小鼠身上证明了肠道微生物群消耗（通过抗生素治疗）会影响内在的收缩肌耐力和葡萄糖稳态。通过重新播种天然细菌可以使这些有害影响正常化。使用无菌动物模型或益生菌作为增强体能的潜在增效剂的研究进一步支持了这样的假设，即靶向肠道微生物群调节对于肌肉功能和体能表现至关重要。所有这些发现为开发用于控制肠道微生物群的治疗工具铺平了道路，目的是优化（在运动员中）或恢复肌肉功能（在患有肌肉病、恶病质、肌肉减少症或患有骨骼肌损害的疾病的患者中）由于活动不足而使肌肉“退化”）。

另一方面，低活性对人体肠道微生物群的影响在很大程度上仍未得到充分研究。来自太空医学的有限数据表明，肠道细菌对微重力敏感，因为太空飞行会影响宇航员胃肠道的微生物组成。目前，活动不足和久坐不动的生活方式很普遍，并对健康和社会经济产生负面影响。世界卫生组织的流行病学调查表明，在世界上，31%的15岁以上人口有久坐行为，久坐的生活方式是世界上第四大死亡风险因素（6%）。事实上，缺乏体力活动会导致肥胖、心血管疾病、II型糖尿病、癌症和骨骼肌无力。因此，科学和医学界应该研究缺乏活力与肠道微生物群组成之间的潜在功能联系，肠道微生物群组成是宿主健康的主要决定因素。

这项介入性研究的目的是确定干浸（DI），一种创新的严重低活性模型，在严格控制的饮食条件下对健康男性肠道微生物群组成的影响。对16S rRNA宏基因组测序数据的分析可以确定DI前后5天收集的粪便样本中的α和β多样性以及门、目和科的丰度。我们的研究结果表明，短暂但严重的运动不活跃足以引起肌肉萎缩，并在较低的分类水平和微生物来源的丙酸盐的可得性上引起一些变化，而肠道微生物群落的总体组成保持不变。作为骨骼肌，肠道细菌对低活性很敏感，这就提出了它们在长期久坐的生活方式中相互影响和作用的问题。

结果

1 尽管控制和保留了营养摄入量，干浸法仍诱发了肌肉萎缩

DEXA分析（表2）显示，在BDC-4和DI-5之间，参与者全身和腿部的瘦体重明显下降（分别为-2.5%，p<0.001；和-2.9%，p<0.001），证实了DI-5天诱发的肌肉萎缩。所有参与者的脂肪质量百分比都没有变化（BDC-4时为24.0±2.9%，DI-5时为23.9±3.0%）。我们记录了每个参与者的每日营养摄入量（碳水化合物、蛋白质、总脂肪和脂肪酸、水、纤维、主要矿物质和维生素）（表3和表4）。DI前的每日热量摄入约为2625千卡，DI期间为2160千卡（无明显差异）。没有观察到DI对营养素摄入的时间效应。

表2 干浸实验5天对全身和腿部（左右）瘦体重的影响。

数据为平均值±SD。DI = Dry Immersion干浸；BDC = Baseline Data Collection基线数据收集；CTL = control group（对照组）；CUFFS环带= group with cuffs（环带组）；ALL =全部样本。只有时间效应（DI-5 vs. BDC-4）显著（*** p < 0.001），而无组或交互效应（双向方差分析）。

表3 每日营养摄入量。

数据为均值±SD；BDC-4:基线数据采集，DI前4天；BDC-3:基线数据采集，DI前3天；BDC-2:基线数据采集，DI前2天；BDC-1:基线数据采集，DI前一天；DI 1:干浸第一天；DI 2:干浸第二天；DI 3:干浸第三天；DI 4:干浸第4天；DI 5:干浸第五天；R + 0:卧床恢复第一天；R + 1:卧床恢复第二天；无时间效应（重复测量的双向方差分析）。

表4 每日维生素摄入量。

数据为均值±SD；BDC-4:基线数据采集，DI前4天；BDC-3:基线数据采集，DI前3天；BDC-2:基线数据采集，DI前2天；BDC-1:基线数据采集，DI前一天；DI 1:干浸第一天；DI 2:干浸第二天；DI 3:干浸第三天；DI 4:干浸第4天；DI 5:干浸第五天；R + 0:卧床恢复第一天；R + 1:卧床恢复第二天；无时间效应（重复测量的双向方差分析）。

2 主要微生物群的丰度不受干浸实验的影响 

为了确认组间DNA提取的相似数量和质量，进行了“所有细菌”的qPCR分析（图2a）。正如预期的那样，总体而言，“所有细菌”的数量在DI-0（12.71±0.26 log细菌细胞/g粪便）和DI-5（12.69±0.22 log细菌细胞/g粪便）的受试者中是相当的，从而证实了提取方法的稳健性。此外，qPCR分析表明，三个主要门水平的丰度在DI-0和DI-5之间没有变化：拟杆菌P（11.66 ± 0.10 log10 vs. 11.62 ± 0.08 log10）、厚壁菌P（11.72 ± 0.10 log10 vs. 11.68 ± 0.09 log10）和变形菌P（9.62 ± 0.18 log10 vs. 9.67 ± 0.14 log10）（图2b）。由于其稳健性，“所有细菌”的定量被用作qPCR门水平定量的基线对照（所有“管家”细菌）。各门水平丰度相对于“所有细菌”丰度的统计分析，以2-ΔΔCt表示，显示在DI-0和DI-5之前没有差异（图2c）。宏基因组分析证实了这一点，这三个主要门和放线菌门的丰度没有任何变化（见下文）。

 图2 通过qPCR进行肠道微生物群组成分析。（a）健康男性（n=14）在干浸之前（DI-0）和干浸5天之后（DI-5）通过qPCR评估的 “所有细菌”丰度。（b）健康男性（n=14）在DI-0和DI-5时通过qPCR量化的三个主要肠道微生物群的平均丰度。（c）健康男性（n=14）通过qPCR对DI-0和DI-5的 “所有细菌”丰度进行归一化后的每个门的平均丰度。所有板块在DI-0和DI-5之间无明显差异（配对t检验）；p为Phylum，门。数据为平均值±SEM（标准误）。

3 干浸处理对α和β多样性无显著影响

为了测量DI后微生物群的整体变化，通过对粪便样本（n=14名男性）进行16S rRNA宏基因组测序，比较了DI前（DI-0）和DI后（DI-5）的分类情况的α和β多样性。该分析表明，α多样性（Observed指数、Chao1指数、Shannon指数和InvSimpson指数）没有被DI改变（图3a）。此外，单个图显示所有参与者的所有α多样性指数都有类似的变化（图3b），在DI-0和DI-5之间没有明显的差异（Observed指数：p=0.166；Chao1：p=0.984；Shannon：p=0.121；InvSimpson：p=0.348）。这些发现表明，DI对肠道微生物群的丰富性和均匀性没有影响。同样，用Jaccard（p=0.998）、Bray-Curtis（p=0.997）和UniFrac（p=0.999）指数从异质性矩阵建立的PCoA图（图3c）解释β多样性，没有发现DI-0和DI-5之间有任何区别。这些结果表明，DI对OTU多样性没有影响。

图3 健康男性（n=14）在干浸前（DI-0）和干浸5天后（DI-5）的α和β多样性指数。（a） 用Observed指数、Chao1指数、Shannon指数和InvSimpson指数评估的α-多样性。成对t检验没有发现不同时间点之间的任何明显差异。（b） 用Observed指数、Chao1指数、Shannon指数和InvSimpson指数评估个体α-多样性。（c） 使用Jaccard（p=0.998）、Bray-Curtis（p=0.997）和UniFrac（p=0.999）指数的β-多样性分析表明，DI-0和DI-5之间的微生物OTU缺失/存在、丰度或系统发育（PERMANOVA分析）没有差异。数据为平均值±SEM（标准误）。

4 DI影响与梭状芽胞杆菌目Clostridiales和毛螺菌科Lachnospiraceae相关的OTUs，影响与厌氧糖酵解相关的细菌功能概况

宏基因组分析给出了与qPCR分析类似的个体和整体系统丰度的结果（图4a,b）。四个主要门类的丰度没有因为5天的DI处理而改变（图4b）。对32个科和44个相关属的宏基因组分析表明，5天的DI使与梭状芽胞杆菌Clostridiales目相关的OTU从65.5%上升到69.3%（p=0.015；图4c）。此外，毛螺菌科Lachnospiraceae（厚壁菌门Firmicutes）的相对丰度因DI而增加（DI-0时为0.202±0.01，DI-5时为0.241±0.01；p＜0.01（图4d）。为了更好地了解DI-0和DI-5之间细菌功能谱的差异，利用PICRUSt2分析得出功能宏基因组内容。MetaCyc本体论预测显示，使用Student t检验，有三条途径显著不同：纯乳酸发酵（ANAEROFRUCAT-PWY；n=14；DI-0=6350.5 ± 262.8 vs. DI-5=5289.1 ± 377.1； p=0.035）和糖酵解（GLYCOLYSIS；n=14；DI-0=7399.8 ± 254.5 vs. DI-5=6300.0 ± 373.5； p=0.027），在这两个途径中，DI-5与DI-0相比都有所下降。而关于硫胺二磷酸盐生物合成I途径的噻唑成分（PWY-6892；n=14；DI-0=5435.8 ± 160.8 vs. DI-5=6343.8 ± 272.6；p=0.010），我们强调DI-5与DI-0相比有所增加。

图4 通过16S rRNA测序门水平的丰度。（a）健康男性（n=14）在干浸前（DI-0）和干浸5天（DI-5）后的4个主要门水平的肠道微生物群的丰度。（b）健康男性（n=14）在DI-0和DI-5时这4个主要门的丰度比较（t检验）。（c）梭状芽孢杆菌目Clostridiales的丰度因DI而明显增加。（d）毛螺菌科Lachnospiraceae的丰度因5天的干浸实验而增加。p为门；O为目；F为科；*p< 0.05；**p < 0.01（配对t检验）。数据为平均值±SEM（标准误）。

5 干浸5天后丙酸盐产量降低

粪便样品中SCFAs的定量突出表明，与DI-0相比，DI-5的丙酸盐浓度明显下降（DI-0时为17.8±1.2 μmol/g粪便，DI-5时为16.0±0.8 μmol/g粪便，p <0.05）（图5）。DI处理对丁酸盐和乙酸盐没有任何影响。

图5 干浸前（DI-0）和干浸5天后（DI-5）收集的粪便样本（n=14）的SCFA定量。*p < 0.05（配对的Student t检验）。数据为平均值±SEM（标准误）。

讨论

我们的研究结果表明，短时间的严重运动不足（足以诱发健康人的骨骼肌萎缩）增加了与梭状芽孢杆菌目Clostridiales和属于厚壁菌门Firmicute的毛螺菌科Lachnospiraceae相关的OTU，而对α-和β-多样性指数没有任何影响。此外，在低活性期后收集的粪便样品中，丙酸盐——由骨骼肌代谢的短链脂肪酸SCFA，明显减少。

低头卧床和最近的DI实验已经被验证为可靠的地面模型，用于研究人类活动不足的生理影响，并成功地用于描述和评估与活动减少有关的肌肉变化。然而，DI比低头卧床法更快地再现了活动不足对肌肉骨骼系统的影响。在固定或久坐不动的生活方式、衰老过程、慢性疾病和微重力条件下，活动不足对骨骼肌质量的负面影响在健康受试者中得到了充分证明。这主要是由肌肉质量的损失和肌纤维萎缩引起的，由调节肌肉蛋白质平衡的信号通路的失调所引起（即蛋白水解、细胞凋亡）。对动物模型和人类的研究表明，肌肉质量的下降是指数级的，并且在最初几天就有重大变化。在本研究中，DEXA分析显示，DI-5天对腿部瘦体重有显著影响（-2.5%），证实了DI诱导骨骼肌萎缩。这一结果与DI-3天后观察到的肌纤维横截面积的显著减少是一致的。由于参与者的营养/热量摄入被严格监控，并且在干预期间没有明显变化，我们的研究强调了活动不足对骨骼肌萎缩的直接影响，与能量摄入无关。

目前的文献支持这样的观点，即肠道微生物群的组成受到体育锻炼和饮食的调节，在健康人、运动员和老年人中存在着功能性的“肠道-骨骼肌轴”。相反，运动不足对肠道菌群的影响在很大程度上仍然是未知的，现有的数据主要来自微重力研究。目前在健康男性中使用DI进行实验，为这个问题提供了一些独到的见解。

首先，尽管对肌肉萎缩有明显的影响，但DI并没有在门水平上诱发任何明显的所有组分的变化，这在人类和鼠类的航天研究中已经报道过。同样，α和β多样性也没有因为5天的DI而改变，部分地与微重力研究的数据一致。事实上，Voorhies和他的同事在进行了6个月到1年的太空飞行任务后，并没有发现人类α多样性的任何变化。相反，β多样性在太空飞行任务中被暂时改变，但在任务前和任务后的数值之间没有任何明显的差异。同样，Ritchie及其同事在小鼠模型中，在13天太空飞行后没有观察到α多样性的任何变化，但报告了地面组（对照组）和飞行组之间按PCoA的不同聚类（β多样性）。在我们的研究中，DI后没有β多样性的变化可以证实人类肠道微生物群的稳定性。

另一方面，在较低的分类水平上，DI导致了梭状芽孢杆菌目Clostridiales和毛螺菌科Lachnospiraceae的OTU的明显变化。DI诱发了梭状芽孢杆菌目Clostridiales OTU的增加，该目占厚壁菌门约70%。同样，在大鼠太空飞行13天后，与梭状芽胞杆菌目相关的OTUs增加了（+60%）。毛螺菌科LachnospiraceaeF是一个在系统发育和形态上异质的分类群，属于厚壁菌门的梭状芽孢杆菌类群XIVa。在其宿主体内，这个厌氧菌家族产生SCFAs，将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，并促进对肠道病原体定植的抵抗。在我们的研究中，与毛螺菌Lachnospiraceae-相关的OTU的明显高丰度可被解释为对活动不足的积极适应，因为其减少之前一直与负面的健康影响有关。此外，该家族作为益生菌的引入增加了对艰难梭菌Clostridium difficile等致病菌的免疫抵抗力。然而，Sorbara等人强调了属于毛螺菌科Lachnospiraceae的共生细菌物种的种间和种内多样性，这是一个重要的发现，因为该家族的一个成员（活泼瘤胃球菌Ruminococcus gnavus）与克罗恩病的发病机制相关。这些结果表明，与活动不足有关的微生物群变化对系统性炎症和免疫成分的潜在影响。有趣的是，在活动不足的后肢截断小鼠模型中也观察到毛螺菌科Lachnospiraceae OTU的增加。同样，在国际空间站停留37天后，属于毛螺菌科Lachnospiraceae的各种属和种在小鼠体内都有所增加。这些数据表明，毛螺菌科Lachnospiraceae对活动不足特别敏感，可能在活动不足-肠道微生物群轴中发挥关键作用。此外，通过使用PICRUSt2分析推断出的功能性宏基因组内容表明细菌厌氧糖酵解途径受损。然而，这一有趣的预测需要在未来进一步调查，以判定对宿主代谢可能产生的后果。

最后，我们发现，在DI 5天后，粪便中的SCFA丙酸盐减少，这表明低活性期阻碍了其在肠道中的生产。我们关于DI对梭状芽孢杆菌Clostridiales和毛螺菌Lachnospiraceae丰度的积极影响的结果表明，与其他SCFA生产者，如Faecalibacterium、Succinivibrio和Butyricimonas相比，这些细菌在其生产中作用有限。有趣的是，SCFAs是研究最多的肠道微生物群对骨骼肌代谢和功能影响的假定介质。因此，DI后丙酸盐的减少引起了它对肌肉功能影响的问题，因为丙酸盐的代谢对ATP的产生很重要，而直肠接种这种SCFA会增加小鼠的跑步时间。由于DI仅持续5天，我们不能排除更长的活动不足期对肠道微生物群组成的更重要影响，特别是对SCFA生产者的影响，从而对骨骼肌的代谢和功能产生影响。因此，活动不足对骨骼肌的负面影响可以部分地由肠道微生物群的改变和相关的SCFA介导的代谢影响来解释。在这种情况下，用于探索人类失重和长时间（长达几个月）活动不足影响的低头卧床方法是进一步研究活动不足-肠道微生物群-骨骼肌轴的一个补充且有趣的策略。

结论

总之，我们的研究结果表明，人类肠道微生物群是决定宿主健康的主要因素，它对活动不足很敏感，并证明有理由对这一主题进行更多的研究，因为久坐的生活方式很普遍，并有许多负面的健康和社会经济后果。未来的研究应该调查肠道微生物群在活动不足和失用中的作用的机制，以及活动不足对“肠道-骨骼肌肉轴”的影响。所有这些数据的整合可能导致识别关键的微生物分类群和活动不足的微生物标志物，可用于提出基于微生物群的靶向治疗方法的营养建议，目的是限制活动不足对宿主健康的负面影响。