基于脑组织转录组整合分析探索大鼠氯胺酮的麻醉机制

李文龙 李春竹 严佳 王皓 马晓凡 姜虹

上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科，上海 200011

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(01):17-23.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210401‑00452

 基金项目 

国家自然科学基金（81901070）；

上海市青年科技英才扬帆计划（19YF1427700）；

九院基础研究助推计划（JYZZ047，JYZZ120）；

上海市科学技术委员会科研计划项目（17DZ1205403）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究对氯胺酮麻醉后大鼠大脑皮质mRNA表达进行测序，探讨其可能的麻醉机制。

1 材料与方法      

选择5~6周龄雄性SD大鼠6只，采用完全随机法分为氯胺酮组（KET组）和对照组（Ctrl组），每组3只。分别腹腔注射麻醉剂量氯胺酮（50 mg/kg）或等体积生理盐水后30 min，提取大脑皮质进行mRNA测序（RNA‑seq），筛选差异表达基因。使用实时荧光定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）进行验证，并通过基因本体（GO）分析、京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析和蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络分析鉴定差异表达基因涉及的相关功能变化。

2 结 果      

2.1　RNA‑seq结果

KET组样本分别为KET1、KET2、KET3，Ctrl组样本分别为Ctrl1、Ctrl2、Ctrl3。在每个样本中检测了21.94 Mbp的原始序列。测序质量≥20的碱基数（Q20）和测序质量≥30的碱基数（Q30）均值分别为97.96%和89.50%，而GC碱基对含量比为50%。在对序列进行整合后，每个样本中的平均总体有效序列为21.86 Mbp，平均总体匹配基因组比率为94.70%，而平均非特异性匹配基因组比率为80.03%。见表1。

2.2　差异表达基因

在确认测序结果质量可靠性的基础上，分析所有样本中转录组基因的相对表达水平（图1）。界定表达改变倍数在2倍以上（|log2FC|≥1）且P<0.05的基因为有显著变化的基因，据此识别出在氯胺酮麻醉后大鼠脑组织中显著上调基因70种，显著下调基因83种。

2.3　RT‑qPCR验证

从显著上/下调基因中各选择4种差异最显著且有相关研究报道的基因用于进一步的RT‑qPCR验证，包括：p53调节凋亡抑制因子1（Triap1）、高迁移率核小体结合域5（Hmgn5）、赖氨酸特异性去甲基化酶4d（Kdm4d）、转录下调因子（Dr1）、外泌体复合物7（Exoc7）、色氨酸羟化酶1（Tph1）、芳烃受体互作蛋白1（Aipl1）和aph‑1同源基因B（Aph1b）。PCR结果提示，上述基因的相对表达水平变化与测序结果一致（图2）。Pearson相关分析提示，RT‑qPCR结果与测序结果的相关系数=0.95（图2），提示本研究中RNA‑seq结果可靠，能用于进一步分析

2.4　差异表达基因的生物学功能预测

GO分析显示，上调基因和下调基因主要与细胞功能、细胞进程、细胞器、生物调节、分子结合等相关。上调基因大多与基因调控和生物学进程调控相关，下调基因涉及功能大多与感觉系统有关，尤其是视觉系统，如视觉知觉、光刺激的感官知觉、光感受器内段、光刺激检测等。

KEGG通路分析提示，上调基因中涉及基因数量最多的通路包括翻译、信号转导、内分泌系统和物质代谢。其中，核糖体功能相关通路涉及的基因数量最多。与此同时，也有大量基因与免疫相关通路有关。下调基因的结果与GO分析结果一致，感觉系统（如光传导）发生显著改变。血清素能突触、胆碱能突触、γ‑氨基丁酸能突触和谷氨酸能突触等与神经功能相关通路也参与其中。在上述通路中，差异最显著的3个通路分别为核糖体（图3）、血清素能突触（图4）和光传导（图5）。

2.5　差异表达基因编码PPI网络

进一步分析上述差异表达基因所编码的蛋白相互作用网络，主要涉及9种下调基因和4种上调基因，构成3个独立的网络（图6）。这13个基因分别为：G蛋白γ亚基转导蛋白2（Gngt2）、G蛋白γ亚基转导蛋白1（Gngt1）、光传感因子（phosducin, Pdc）、环核苷酸门控通道β1（Cngb1）、鸟苷酸环化酶激活因子1b（Guca1b）、视锥‑视杆同源盒（Crx）、胰岛因子2（Isl2），鸟苷酸环化酶激活因子1a（Guca1a）、Tubby样蛋白1（Tulp1）、双特异性磷酸酶1（Dusp1）、高半胱氨酸蛋白61（Cyr61）、Kruppel样因子4（Klf4）和B细胞异位基因2（Btg2）。编码的蛋白主要为光传导和细胞周期相关蛋白。光传导相关蛋白可能参与了麻醉机制的形成，而细胞周期相关蛋白可能与神经元发育、凋亡和突触可塑性有关。

3 讨 论

本研究采用RNA‑seq技术分析氯胺酮麻醉对大鼠大脑皮质中mRNA表达的影响，识别显著上调/下调基因并进行基因功能分析，为探索氯胺酮诱导麻醉的潜在机制提供了方向。

本研究中差异基因功能主要集中在翻译、光传导、神经突触功能、物质代谢和免疫等方面，如5‑羟色胺能突触。研究表明，使用5‑羟色胺受体拮抗剂可以增强氯胺酮的麻醉效果，也有很多研究认为5‑羟色胺参与了吸入性麻醉药的麻醉机制。另一方面，5‑羟色胺在疼痛调制和记忆形成过程中也扮演了重要角色。这与我们的结果是一致的。氯胺酮给药后会引起5‑羟色胺能突触通路中5‑羟色胺合成、再摄取以及突触后信号转导等过程相关基因的表达发生明显变化。因此，我们认为氯胺酮可能通过5‑羟色胺系统发挥麻醉作用。

在本研究中视觉系统相关基因和通路的变化也十分显著，如光传导。目前这些基因在麻醉机制中作用的相关研究较为欠缺。但它们在睡眠中的作用已经得到证实。考虑到睡眠与麻醉之间的相似，通过睡眠通路来理解麻醉也是研究机制的常用方法之一。其中Crx能广泛调控松果体中的激素，尤其是褪黑素的分泌。研究发现，褪黑素具有与硫喷妥钠和异丙酚相似的麻醉特性，并具有与氯胺酮相似的强大的镇痛作用。在本研究中氯胺酮麻醉后Crx表达发生显著改变。

本研究中基因表达和翻译的相关基因发生了明显变化。核糖体作为细胞内翻译蛋白质的场所，涉及差异表达基因数量最多。氯胺酮等全身麻醉药可能通过影响神经内分泌神经肽的分泌发挥麻醉效应。本研究支持了这一观点，提示神经内分泌系统可能是全麻机制研究方向之一。

本研究存在一定局限性：样本未区分不同脑区，故无法辨别各脑区在氯胺酮麻醉中发挥的具体作用；RNA‑seq结果中各基因表达改变与氯胺酮麻醉之间的因果关系需要更多相关研究加以验证。

本研究使用高通量测序对氯胺酮麻醉后大鼠大脑皮质中mRNA表达变化进行检测，研究发现5‑羟色胺系统、神经内分泌系统和视觉系统相关基因可能在氯胺酮麻醉中发挥一定作用。本项研究为日后进一步阐述氯胺酮麻醉机制提供了一个方向，未来还需要进行更多的工作以深入阐明氯胺酮的麻醉机制。