程敬伟 苏建荣 | 艰难梭菌感染与万古霉素耐药肠球菌定植相关性分析

• 作者：程敬伟  刘畅  孙宏莉  徐英春  苏建荣

艰难梭菌是一种产芽孢革兰阳性厌氧菌。大量应用广谱抗菌药物、免疫抑制剂或化疗药物后可导致肠道菌群失调，艰难梭菌优势繁殖引发艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection, CDI）[1]。艰难梭菌是最常见的院内感染病原体之一，约10%~25%的抗生素相关性腹泻及90%以上的伪膜性肠炎是由CDI引起[2]。

近年来，万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)已经逐渐成为医院感染的重要病原菌，可引起尿路、腹腔、伤口感染以及血流感染等。VRE感染的风险因素包括抗菌药物使用、免疫抑制、粒细胞缺乏症、肾功能不全、入住ICU等。

为探究艰难梭菌感染与VRE定植的相关性，本研究分析了北京某三甲医院送检艰难梭菌毒素检测粪便标本VRE的定植情况，现报告如下。

一、材料与方法

01 标本来源：收集2016年1月至2017年9月之间就诊于北京某三甲医院送检艰难梭菌毒素检测非重复腹泻患者粪便标本301份。

02 细菌培养及鉴定：艰难梭菌培养使用ChromID® C. difficile选择培养基，标本接种后置于厌氧产气袋内培养48h，VRE培养使用ChromID® VRE选择培养基需氧培养48h，典型菌落传种至哥伦比亚血琼脂培养基并分离出单个菌落，进行MALDI-TOF MS（布鲁克公司）质谱鉴定。所用培养基购自梅里埃（上海）生物制品有限公司。

03 核酸提取及毒力基因检测：

（1）核酸提取：向1.5ml EP管中加入200μl核酸提取液（上海之江生物科技有限公司），使用1μl一次性接种环挑取5-10个菌落，在EP管中沿着管壁研磨，涡旋振荡2min，100°C金属浴10min，离心取上清作为DNA模板。（2）毒力基因扩增：使用5重PCR的方法扩增艰难梭菌的16S rDNA、毒素A、B编码基因tcdA、tcdB，以及二元毒素基因cdtA、cdtB，并对tcdA基因是否存在1.8kb片段缺失进行确证，扩增产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳判定结果。

04 产毒素培养（Toxigenic culture, TC）：粪便培养分离艰难梭菌，再使用PCR方法检测菌株是否含有毒素基因。

TC阳性：培养分离到艰难梭菌，且检测到毒素基因；TC阴性：未分离到艰难梭菌，或分离到艰难梭菌但未检测到毒素基因。

05 药敏试验：采用E-test法检测万古霉素对屎肠球菌最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。从血平皿上挑去单个菌落，使用生理盐水制成0.5麦氏标准菌悬液，均匀涂布于MH琼脂表面，将E-test条（郑州安图生物工程股份有限公司）贴在已接种细菌的琼脂表面并轻压，35℃孵育16-20h。第二天判读结果：纸条和透亮的抑菌带交界处的抗菌药物浓度刻度为MIC值，折点判定参考CLSI 2019年版M100-S29文件，即MIC≥32ug/mL为耐药。

06 多位点序列分型（Multilocus-sequence typing, MLST）：根据艰难梭菌及屎肠球菌MLST分型官方网站（http://pubMLST.org/cdifficile）、（https://pubmlst.org/efaecium）推荐的方法，扩增位于艰难梭菌及屎肠球菌染色体上的7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）、（adk、atpA、ddl、gdh、gyd、purK、pstS），PCR产物送至北京睿博兴科生物技术公司测序，序列提交至官网比对分析每个基因的等位基因（allele），进而确定菌株的序列型（sequence type, ST）[3，4]。

07 统计分析：采用SPSS 17.0软件，使用卡方检验的方法统计CDI与VRE定植的相关性，P<0.05为具有统计学差异。

二、结果

01 TC与VRE定植的相关性：301份粪便标本中共分离154株艰难梭菌，其中产毒素艰难梭菌135株，不产毒素艰难梭菌19株，147份标本未培养出艰难梭菌。ChromID® VRE选择培养基共分离出具有紫色菌落特征的菌株12株，经MALDI-TOF MS鉴定为屎肠球菌，且万古霉素MIC值均≥32ug/mL。

VRE的检出率为4.0%（12/301），其中8株分离自TC阳性粪便标本，检出率为5.9%（8/135）；4株分离自TC阴性粪便标本，检出率为2.4%（4/166），TC阳性标本VRE检出率高于TC阴性标本，但无统计学差异，P=0.121，见表1。

02 艰难梭菌毒素基因检测及MLST分型：135株TC阳性艰难梭菌中，大多数菌株为产A、B两种毒素，即A+B+型113株，占83.7%；其次为仅产B毒素A-B+型菌株19株，占14.1%；产A、B及二元毒素的A+B+CDT+型菌株3株，占2.2%。

分离率最高的5个序列型为ST2、ST54、ST3、ST42和ST81型，分别占23%、14.8%、11.8%、8.1%和7.4%。8株VRE菌株分离自ST1、ST3、ST8和ST81型艰难梭菌粪便标本；TC阳性艰难梭菌中，ST81型艰难梭菌粪便标本VRE分离率较高，为40%（4/10），见表2。

03 VRE多位点序列分型：12株VRE菌株MLST分型显示，ST78型为主要的型别，共8株，其他型别包括ST17型2株，ST230、ST547型各1株。4份ST81型艰难梭菌粪便标本中检出2株ST78型、1株ST17型和1株ST230型VRE。TC阴性标本中4株VRE的序列型均为ST78型。VRE型别与艰难梭菌型别的关系见表3。

三、讨论

本研究发现，TC阳性粪便标本VRE的分离率高于TC阴性粪便标本，但无统计学差异，可能由于本研究涉及的菌株和样品较少。土耳其的一项研究表明，艰难梭菌毒素阳性粪便标本VRE的检出率显著高于毒素阴性标本（17% VS 11.4%， P<0.05）[5]，这可能与其抗菌药物使用情况及院内感染防控措施相关。 

本研究发现ST81型艰难梭菌粪便标本VRE的分离率较高，我们之前的研究表明，ST81型艰难梭菌是一种高度耐药细菌，其对喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素类等多种抗菌药物的耐药率均在90%以上[6]。此外，ST81型菌株在北京、上海地区多家医院的分离率排名第一，并引起院内感染及暴发流行。ST81型艰难梭菌粪便标本VRE的高定植率可能与患者肠道微生态的失衡相关，有待进一步深入的研究确证。 

治疗艰难梭菌感染的最常用的抗菌药物是甲硝唑和万古霉素，有研究显示，与甲硝唑相比，口服万古霉素治疗CDI没有增加VRE感染的风险[7,8]，且口服万古霉素预防CDI也没有增加VRE定植的机会[9]，但是对于复发性CDI，预防性使用万古霉素后VRE定植的机会却增加[10]。本研究发现，该医院艰难梭菌最常见的型别为ST2、ST54和ST3型，而金大智等研究者发现浙江省流行率最高的是ST37型[11]，近期研究表明北京地区流行率最高的为ST81型[6]，不同地区报道的艰难梭菌流行型别具有一定差异，且高毒力RT027型艰难梭菌已经在北京、广州、武汉、济南、石家庄等地区报道，因此，开展艰难梭菌流行病学主动监测十分必要。 

本研究发现VRE最常见的型别为ST78型，这与上海、西安等多个地区的报道一致[12,13]。艰难梭菌毒素检测粪便标本VRE检出率为4.0%，略高于2013年10月-2014年9月我国46所综合医院ICU病房VRE的检出率（3.85%）[14]。中国细菌耐药监测网2019年数据显示，万古霉素耐药屎肠球菌的检出率为1%[15]。有研究表明，院内感染暴发的VRE基因型与肠道内定植VRE基因型相同，对VRE易感的高危患者采取定植筛查策略是预防VRE院内感染暴发流行的有效措施。

本研究未发现艰难梭菌感染与VRE定植具有明显相关性，临床应合理使用抗菌药物，主动开展细菌监测，做好院内感染防控，防止艰难梭菌及VRE的暴发流行。

【参考文献】

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编辑 | 骆秉涵  王迪