【醉翁之艺】肠道微生物调节由睡眠剥夺引起的炎症反应及认知损伤的研究

睡眠剥夺（SD）现象在当今社会越来越普遍，不仅会引起炎症反应失调，也会导致认知功能损伤，但其具体发生机制并不明确。新的证据表明，肠道微生物群可通过与大脑的相互作用以及神经炎症在炎症和精神疾病的发病和发展中发挥关键作用。

北京大学第六医院YingHan团队调查了SD对肠道菌群组成的影响，并探讨了肠道菌群的改变是否与SD引起的慢性炎症状态和认知障碍存在因果关系，其成果发表于MolecularPsychiatry杂志。

【研究背景】

睡眠剥夺(SD)扰乱了全球数百万人的生活，严重影响了人类的认知和身体健康状况。其中肠道菌群-炎症-脑轴是近年来日益流行的研究热点。肠道菌群可影响肠道屏障通透性，通过控制免疫激活和小胶质细胞功能，参与调节宿主免疫系统和神经功能，其改变与精神疾病的病理生理学也有关，可能介导了睡眠剥夺造成的不利影响。

本研究使用了16SrRNA基因测序来测试SD对健康年轻个体肠道菌群的影响。此外，评估了肠道菌群的改变是否与SD诱导的慢性炎症状态和认知障碍具有因果作用。本研究利用小鼠的基线情况(BL)或将SD微生物群移植于无菌(GF)小鼠完成肠道微生物群重塑，然后进行血清学、行为学和免疫组化试验来评估认知和炎症。

【实验材料和方法】

参与者

本研究招募了25名健康参与者（其中包括13名男性）。在参与研究之前，参与者报告了至少6个月有规律的睡眠-觉醒时间表。他们遵循有规律的就寝时间（晚上11点±30分钟就寝，早上7点±30分钟起床），以尽量减少之前睡眠不足对结果的影响。该临床试验在中国临床试验注册中心(no.ChiCTR-ROC17012112)。所有研究流程均经北京大学第六医院研究伦理委员会批准。所有参与者在参与研究前都提供了书面知情同意书。

实验方案

在完成问卷筛选程序和1周的活动监测后，参与者被要求在睡眠监测中心(北京大学第六医院)生活2天。每个参与者都被要求按照自己的时间表每晚睡8小时。然后在此睡眠时间表后进行40小时睡眠剥夺和8小时恢复睡眠，并进行多导睡眠图监测。 

试验对象

无菌(GF)和无特定病原体（SPF）的BALB/c小鼠在重庆第三军医大学实验动物科学系培育。小鼠居住条件为12小时光照/12小时黑暗的环境，从早上7:30到晚上7:30开灯，温度控制在21-22°C，湿度为55%±5%。实验室使用标准食物和水。动物实验方案由当地伦理委员会(中国重庆第三军医大学)审核通过。 

粪便短链脂肪酸含量测定

采用气相色谱-质谱联用技术测定冷冻粪便和血清样品中的短链脂肪酸。 

微生物群转移实验

随机从5名健康参与者中获取基线[BL]和SD后[SD-40h]的粪便样本，给目标小鼠做灌胃处理从而达到肠道菌群移植的目的。 

【结果】

1、睡眠剥夺会损害人类的认知功能，增加炎症途径的激活

在本研究中，25名参与者(13名男性)完成了该实验(图1a)。认知注意表现采用精神运动警觉性测试(PVT)进行测量，相较于基线组，SD组表现出明显慢反应时间(F2,48 = 17.800, p < 0.001)和更多的失误(χ2 = 23.363,p <0.001)(图1 b, c)。同时，SD组在蒙特利尔认知评估测试中的总分显著减少(χ2= 7.000,p = 0.030)，记忆领域是受影响最严重的板块(χ2 = 13.000,p = 0.002)。此外，SD组的唾液皮质醇水平显著升高(χ2= 15.680, p < 0.001)，表明SD会增加健康成人的下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的反应性。

本研究发现SD会导致促炎细胞因子的水平包括TFN-α(F2,38 = 15.778, p < 0.001), IL - 1β(F2, 38 = 12.316, p = 0.002),和IL - 6(χ2= 21.700，p < 0.001)的表达增加，并降低抗炎细胞因子的水平如IL-10(χ2 = 13.300,p = 0.001)(图1d)。在SD24小时后，血清LPS浓度(F2,48= 11.045, p < 0.001)显著升高，其主要通过激活细胞表面TLR4引起炎症活化，导致NF-κB转录活化炎症基因，包括促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β。

2、睡眠剥夺会引起人体的肠道微生物群与代谢失调

为了阐明SD改变肠道微生物群的方式，本研究对BL组的粪便样本以及SD24 h (SD-24 h)和40 h (SD-40 h)后的粪便样本进行了16SrRNA基因测序。研究发现，与BL相比，SD后肠道菌群α-多样性显著降低。SD导致肠道菌群组成发生了急剧而迅速的变化。SD处理24h后，观察到的菌群种类(F2,48 = 9.427, p <0.001)和chao1指数(F2,48 = 5.606, p = 0.011)显著下降，SD处理40h后，肠道菌群α多样性进一步下降(图1e)。此外，利用UniFrac距离度量(β-多样性)来评估SD对群落组成个体间差异的影响提示，各试验组间β-多样性差异显著(PCoA1:χ2 = 6.320, p = 0.042;PCoA2: F2,48 = 3.319, p = 0.055;图1f)。这些结果表明，持续暴露于SD会对肠道菌群有持久的影响，并可进一步减少细菌多样性。

属级水平中，SD大大改变了微生物群的构成,明显减少了g-Prevotella(χ2 = 20.250,p < 0.001), g-Sutterella(χ2 = 6.096,p = 0.047), g-Parasutterella(χ2 = 7.000,p = 0.030), g-Alloprevotella(χ2 = 16.044,p < 0.001), g-Anaeroplasma(χ2 = 13.389,p = 0.001)和g-Elusimicrobium (χ2 = 13.389, p = 0.001)(图1g)。

此外，大多数不同属参与了SCFAs的产生，如g_Alloprevotella、g_Allobaculum、g_Elusimicrobium、g_Prevotella，这些均在睡眠剥夺后显著减少。细菌产生的代谢物如醋酸浓度(F2, 48 = 5.019, p = 0.010),丙酸(F2, 48= 5.555, p = 0.007),和丁酸(χ2 = 13.040,p = 0.001)显著减少，表明SD导致肠道细菌衍生的代谢产物失调（图1h）。此外，SD后大多数差异性富集的人体肠道菌群都与SCFAs表现出了显著的相关性，凸显了肠道菌群对SCFAs代谢的调控作用。为了研究SD是否影响人类肠道完整性功能，本研究检测了血清小环素水平的变化(图1i)，它是上皮和内皮屏障功能的调节因子，已被证明参与了许多慢性炎症性疾病，SD后血清小环素水平显著升高(χ2= 9.360, p = 0.009)。同时，SD后血脑屏障(BBB)通透性标志物血清S100β水平显著升高(χ2= 14.381, p = 0.001;图1j)，这些结果表明，SD可导致肠道微生物群和代谢紊乱以及生理屏障的破坏。

3、小鼠的肠道微生物缺失会抑制睡眠剥夺引起的炎症反应和认知功能损伤

肠道菌群是炎症反应的重要激活因子。通过比较无菌（GF）小鼠和无特定病原体（SPF）小鼠，本研究评估了肠道菌群的缺失是否会在生理上影响SD后的炎症和认知功能(图2a)。与人类结果相似，SD显著提高了SPF(t22 =−3.727,p < 0.010)和GF (t22 =−3.125,p < 0.010)小鼠的循环皮质酮水平(图2b)。SD 24 h后，SPF级小鼠血清中TNF-α (t18 =−6.769,p < 0.001)、IL-1β (t18 =−5.873,p < 0.001)、IL-6 (t18 =−3.650,p = 0.002)水平显著升高，IL-10 (t18 = 2.584, p = 0.019)水平显著降低。而在GF小鼠中，这些炎症细胞因子水平无差异(图2c-f)，表明SD诱导下SPF小鼠的炎症反应更强。

进一步研究SD对肠道屏障的影响，发现SD的SPF小鼠结肠粘蛋白2明显减少。SD没有对GF小鼠肠道屏障造成进一步的损伤(图2h-j)。这些结果表明，肠道菌群的缺失减弱了SD引起的炎症反应和肠道屏障的破坏，提示肠道菌群与炎症反应之间存在潜在的联系。

接着，本研究探索了肠道微生物群对小鼠认知行为的贡献。采用新物体识别(NOR)测验和y -迷宫测验评价认知能力。SPF小鼠的认知能力明显受到干扰，而GF小鼠则没有。SPF级SD组小鼠的识别指数(RI)下降24.26%(t22 = 2.686, p = 0.014)。GF级SD小鼠与GF对照组小鼠相比，RI无显著变化(图2l)。y迷宫实验中也出现了类似的结果，SPF级SD小鼠的交变率显著降低(t22= 2.444, p = 0.023)，而GF级SD小鼠的交变率则没有下降(图2m)。综上所述，这些结果表明肠道菌群在SD诱导的炎症反应和认知障碍中发挥了重要作用。 

4、“SDmicrobiota”的移植增加TLR4/NF-κB信号通路的激活，诱导肠上皮屏障损伤

为了研究“SD微生物群”促进炎症的情况，本研究将随机选取的健康受试者SD前后的粪便样本，移植到GF小鼠体内(图3a)。接种菌群从5名健康参与者的BL和SD-40 h粪便样本(受体BL和SD-40 h，分别加标记的rBL和rSD)汇集的样本中产生（这些参与者事先不知道他们的微生物多样性概况）。

2周后，用SD-40 h供体的样本定植的rSD小鼠表现出与rBL相关的炎症状态增加。具体来说，我们观察到外周血中IL-6 (t18 =−2.853,p = 0.018)、IL-1β (t18 =−4.650,p < 0.001)和TNF-α (t18 =−2.556,p = 0.020)水平显著升高，外周血中IL-10水平显著降低(t18 = 3.114, p = 0.006)(图3b)。与rBL小鼠相比，rSD小鼠血清皮质酮水平也显著升高(p< 0.05)(图3c)。我们还发现，rSD小鼠FMT后血清内毒素水平显著升高(t14=−2.408,p = 0.030)(图3d)。

免疫印迹分析“SD菌群”FMT对lps诱导的TLR4/NF-κB信号通路激活的影响。与rBL小鼠相比，“SD菌群”的FMT显著增加了TLR4 (t16 =−2.628,p = 0.018)和磷酸化的NF-κB p65 (t16 =−3.071,p = 0.007)的表达(图3e-g)。在体内用fitc-葡聚糖试验检测上皮细胞通透性的变化(图3h)。与rBL相比，SD受体结肠黏膜的通透性显著增加(t15=−2.953,p < 0.050)。此外，在rSD小鼠中，PAS阳性杯状细胞面积(t18= 2.553, p = 0.020)和结肠Muc2的表达(t14 = 3.974, p < 0.010)显著降低(图3i-k)。FMT也显著降低了claudin-1 (t12 = 3.600, p = 0.004)和occludens1 (ZO1;t12 = 3.037, p = 0.010)。总之，这些结果表明，与定殖“BL菌群”相比，定殖“SD菌群”的GF小鼠TLR4/NF-κB i炎症通路的激活增加，肠道屏障通透性增强。

5、GF受体小鼠肠道微生物的改变及其与SCFAs减少的关系

为了确保粪便微生物移植（FMT）的保真度，我们收集了用人类粪便样本定植的小鼠的粪便，并对FMT小鼠的粪便样本和它们的人类捐献者的粪便样本进行了16SrRNA基因测序。物种水平的分类组成以操作分类单元(OperationalTaxonomic Units, OTU)为特点。种级OTU的PCoA证实rSD小鼠与rBL小鼠之间存在明显的分离。在供体粪便中存在的289个OTU中，205个OTU存在于受体小鼠的肠道中(图4a)。我们在移植小鼠上发现了显著的β-多样性差异显著(PCoA1:t18 = 5.462, p < 0.001;PCoA2: t18 = 2.008, p = 0.060,图b)。

我们并没有在FMT小鼠上发现与人类供体相同的α-多样性下降，这表明可能是样品处理和/或寄主不亲和性导致细菌种类的变化。采用线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)分析，若LDA评分为log10> 2则认为FMT后菌群发生特异性和特征性的变化。rBL组与rSD组之间丰度差异显著的类群共有46个。LDA图显示有26个属在rSD组更富集，而20个属在rBL更富集。总的来说，人类供体的粪便移植到GF受体小鼠中保持了BL和SD-40小时微生物组谱之间的差异(图4c)。为了确定FMT程序是否在功能上影响肠道菌群，我们测量了粪便和血清中短链脂肪酸的水平。与人类实验结果相似，我们发现rSD小鼠的粪便中乙酸(t18= 4.375, p < 0.001)、丙酸(t18 = 2.227, p = 0.039)和丁酸(t18 =2.526, p = 0.021)浓度显著降低(图4d)。我们进一步检测了FMT小鼠血清中循环SCFAs水平，发现与rBL小鼠相比，循环的丁酸水平显著降低(t18= 4.720, p < 0.001)。在rSD受体小鼠中观察到血清乙酸和丙酸水平下降的不显著趋势(图4e)。这些结果表明，rSD菌群降低了受体小鼠的SCFA水平。这些发现表明，受体小鼠的肠道菌群失调可能是由SD引起的有害影响的原因。

6、“SDmicrobiota”的移植增加了GF受体小鼠的神经炎症和认知行为受损

肠道内的微生物群会影响神经系统的结果。SD会导致认知障碍，并影响大脑许多区域的功能，包括内侧前额叶皮层(mPFC)和海马(HPC)。神经炎症可能是导致这一过程的重要因素。研究发现，SD40h人类的粪便移植到GF小鼠的背侧海马(dHPC)和mPFC中促进了促炎表型，包括促炎细胞因子IL-1β水平的增加(mPFC: t17 =−8.332,p < 0.001;dHPC: t17 =−7.483,p< 0.001) and IL-6 (mPFC: t17 =−3.621,p = 0.005;dHPC: t17 =−2.337,p = 0.032)和抗炎细胞因子IL-10的降低(mPFC:t17 = 6.478, p < 0.001;dHPC: t17 = 8.150, p < 0.001)水平(图5a,b)。

我们还观察到SD微生物移植后小鼠的iba1阳性细胞（海马胶质小细胞标记物）数量(mPFC:t9 =−5.325,p < 0.001;dHPC: t10 =−3.187,p < 0.010) 和面积 (mPFC:t9 =−5.106,p < 0.001)的增加，表明小胶质细胞激活增加(图5c-g)。“SD-microbate”移植小鼠的血清中血脑屏障通透性标志物S100β显著增加(t22=−2.180,p = 0.040)(图5h)。这些结果表明，肠道微生物群的改变可能是引发神经炎症的主要事件。

神经炎症与SD诱导的认知功能损害的恶化有关。我们测试了微生物群的改变是否会导致小鼠的认知障碍。FMT后2周进行两项已确定的行为试验(NOR试验和y迷宫)。在NOR试验中，与rBL小鼠相比，SD相关菌群处理的小鼠的RI降低(t22 = 2.381, p = 0.026)(图5i)。y迷宫试验中，rSD小鼠的交替百分率(t22 = 2.382, p = 0.026)也比rBL小鼠降低了12.97%(图5j)。与rBL组相比,rSD组小鼠表现出与新事物接触率下降，以及在Y迷宫测试中较少花费时间在新的领域。此外,FMT小鼠的认知表现与大脑循环丁酸水平和神经炎症水平显著相关(图5k)。总之，这些结果表明，与定殖“BL菌群”相比，在SD后从人类传递“SD菌群”会导致FMT小鼠神经炎症和认知障碍的增加。

醉翁之艺 点评

睡眠剥夺  即  SD  是最常见的基于实验室的睡眠操纵，  日常工作中有  许多人  （  如卡车司机、  医生  护士等  ）  经常在轮班工作时有这样的经历。与长期慢性的睡眠限制和睡眠碎片化相比，  SD  引起的损伤更为急性和严重。  有大量研究表明，SD  会诱导人类肠道失调、炎症反应和认知障碍。

本研究在此基础上发现，  肠道菌群的缺失抑制了  SD  诱导的无菌小鼠  （  GF  ）  的炎症反应和认知功能障碍。将  “SD  菌群  ”  移植到  GF  小鼠后，  会  激活  TLR4/NF-κB  信号通路，使受体小鼠认知功能受损。带有  “SD  微生物群  ”  的小鼠在海马和内侧前额叶皮层中也表现出神经炎症和小胶质细胞活动的增加。这些发现表明，肠道菌群失调可导致  SD  引起的外周  及  中枢  系统  炎症过程和认知障碍，这可能为缓解睡眠缺失的有害后果开辟了潜在的干预途径。

未来的研究  可能会着眼于  确定导致代谢和神经炎症改变的关键菌株，并阐明肠道微生物群与宿主之间相互作用的机制。除了  TLR4/NF-κB  信号通路外，还需要进一步的研究来了解肠道菌群与  SD  诱导的炎症之间的其他机制联系，并阐明  SCFAs  影响脑功能的方式。  关于  肠  -  脑轴  相关研究的进一步深入，有望在该领域获得有益于临床的新突破。

邱艳丽，庄蕾   

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