针对新型冠状病毒肺炎的基于CRISPR-Cas系统分子诊断及治疗策略研究

中文     当前新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情仍在全球大流行，确诊病例和死亡人数仍不断攀升，如何有效控制病毒的传播，降低传染率和死亡率是目前全人类亟待解决的问题。一方面需要快速、可靠、经济的检测方法及时发现新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染者，另一方面需要寻找新颖、有效的COVID-19治疗及预防策略。各种基于成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein，CRISPR-Cas）系统的新一代基因编辑技术以其快速、便携、经济、高效的特点为COVID-19快速分子诊断提供了解决方案。CRISPR-Cas系统具有可准确识别并降解SARS-CoV-2核酸的特点，为研发针对COVID-19的新型治疗及预防手段提供了一种潜在的技术方案。此文对目前COVID-19诊断及治疗现状进行了分析，对基于CRISPR-Cas系统的COVID-19分子诊断、治疗及预防策略研究及其新进展进行了简述。   文章来源 | 国际生物制品学杂志   文章作者 | 刘锦嵩、鄢盛恺     

正文     当前，由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情仍在全球180多个国家和地区持续蔓延，严重危及全球公共卫生体系和人类生命安全。据WHO统计，截至2021年12月29日，全球累计COVID-19确诊病例超2.81亿，累计死亡人数达541万[1]。多种SARS-CoV-2变异株的陆续出现，尤其是在英国首次检测到的B.1.617变异株（德尔塔毒株）（包括其亚变种AY.4.2）和近日在南非首次检测到的B.1.1.529变异株（奥密克戎毒株）具有传播力强、潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点，已导致全球多国疫情出现反弹。这对进行有针对性的COVID-19临床诊治及预防策略提出了更高的要求。基于成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein，CRISPR-Cas）系统的基因编辑技术近几年发展迅速，应用范围几乎延伸到生命科学的每个角落[2]。基于CRISPR-Cas系统的各种病原体核酸检测方法，不需要复杂昂贵的设备、操作简单，极大地减少了实验室负荷和患者检测成本，使得现场即时检测（point of care test，POCT）得以实现，可及早地追踪和隔离被感染人群，快速阻断病毒传播[3]。诸多研究已尝试将该技术应用到COVID-19的早期诊治及预防，以期开发出更加灵敏快速的病毒核酸检测方法和安全有效的新型治疗及预防方案。本文在简述目前COVID-19诊治现状的基础上，对基于CRISPR-Cas系统的COVID-19分子诊断、治疗及预防策略的研究及其新进展进行简要介绍。 

/01/ COVID-19诊治现状     

1.1常用的SARS-CoV-2检测方法 SARS-CoV-2完整的基因组约为30 kb，其中接近5’端的前2/3包含编码16个非结构蛋白的开放阅读框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）基因，后1/3包含编码结构蛋白的基因包括包膜蛋白（envelope protein，E）、刺突蛋白（spike protein，S）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）、膜蛋白（membrane protein，M）基因[4]。 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）现被作为COVID-19诊断的金标准，WHO和我国均建议选用至少包含针对ORF1ab和N基因区域的qRT-PCR核酸检测试剂盒（包含TaqMan聚合酶、引物和探针）作为COVID-19确诊方法[5]。但在感染早期qRT-PCR检测仍可呈假阴性，同时有检测成本贵、样本运转/检测周期长以及人员和设备要求高等缺点[6]。应用间接免疫荧光法、直接发光免疫法、ELISA、胶体金免疫层析等技术检测呼吸道分泌物中的SARS-CoV-2抗原或血清抗体，也被各国作为SARS-CoV-2感染诊断或治疗监测的辅助手段。虽然这些免疫学检测抗原或抗体的试剂有的已上市并应用于临床检测，但仍存在交叉反应、检测窗口期较长、假阳性率高等许多缺陷[7]。 

1.2目前COVID-19的治疗与预防手段 迄今为止，全球各国已经评估了各种可能的COVID-19治疗与预防手段，其中包含多种化学药物、中和抗体和各种处于不同临床试验阶段或已经上市的疫苗。对于COVID-19具有潜在疗效的候选药物有瑞德西韦、洛匹那韦、氯喹和羟氯喹、法匹拉韦等，虽然这些候选药物在小规模临床试验中均被证明具有一定的抗SARS-CoV-2活性，但在WHO牵头组织的全球最大用于评估COVID-19治疗方法的临床试验——“团结”试验（SOLIDARITY trial）中瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦对COVID-19的治疗效果都十分有限甚至无效[8]。好消息是法匹拉韦已在多个国家的临床试验中展现出有效性，尤其是针对轻症和中症患者的治疗，并且在包括中国在内的多个国家上市；最近，抗SARS-CoV-2口服药Molnupiravir获英国药监局批准上市，用于成人轻症至中症COVID-19的治疗[9]；美国辉瑞公司新口服药PAXLOVIDTM的Ⅱ/Ⅲ期临床试验结果显示，该药可使患者重症或者死亡风险降低89%，目前已向美国FDA提交紧急使用授权（emergency use authorization，EUA）申请[10]。清肺排毒汤、化湿败毒方、宣肺败毒颗粒、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、血必净注射液等3个中药方剂和3个中成药已被证实对COVID-19有明显疗效，联合西药治疗可明显提高治愈率。 中和抗体疗法也是治疗COVID-19的一个热门领域，如从COVID-19康复患者的恢复期血浆中筛选出的单克隆中和抗体，通过与SARS-CoV-2的S蛋白结合，阻断病毒与宿主细胞结合，病毒无法侵入细胞，最终被免疫系统消灭。全球现有20种中和抗体药物研发进入临床试验，其中美国礼来公司和上海君实生物医药科技股份有限公司合作开发的Etesevimab/Bamlanivimab联合疗法、美国再生元制药公司的卡西瑞单抗和伊德单抗组合疗法、美国VirBiotechnology公司和英国葛兰素史克公司合作的Sotrovimab均已获得美国FDA的EUA。 针对全球COVID-19疫情的暴发及蔓延，世界各国都加快了疫苗的研发、生产及审批，乃至授权应急使用审批速度，以满足提高公共群体免疫水平、有效控制疾病流行需要。WHO于2021年10月28日更新的COVID-19疫苗紧急使用名单显示，24种COVID-19候选疫苗中已通过认证并获准紧急使用的仅14种（包括我国2种），其他10种疫苗尚未完成相关认证。此外，WHO最近发布的全球COVID19疫苗开发概况表明，已有322种候选疫苗，其中128种处于临床试验阶段[11]。目前已有的COVID-19疫苗包括灭活疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗等。随着更加深入的研究，核酸疫苗在免疫原性、安全性和持续性方面都获得了极大的进步，其中为应对COVID-19疫情首次使用的mRNA疫苗尤为引人关注[12]。mRNA具有良好的保护效力且安全性可控，可在体内正常降解，理论上不会与宿主基因整合，与传统疫苗相比，生产周期更短、研发成本更低，但运输与保存条件的要求更高。目前，美国辉瑞公司/德国BioNTech公司联合研制的BNT162b2 mRNA疫苗以及美国Moderna公司开发的mRNA-1273疫苗已获得紧急使用批准上市。 

/02/ 基于CRISPR-Cas系统的COVID-19分子诊断     

2.1基于CRISPR-Cas13的COVID-19诊断 Cas13a是CRISPR-Cas家族中唯一一种可以靶向单链RNA的效应蛋白，且具备非特异性反式切割邻近单链RNA的活性，这些特性可以靶向识别目标RNA并利用报告分子的断裂将信号放大，为利用CRISPR-Cas13检测RNA病毒SARS-CoV-2提供了机会。华裔学者张峰团队建立的一种基于Cas13a的特异高灵敏度酶报告系统（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK）已被用于检测SARS-CoV-2，在42个RNA拷贝的检出限内荧光读数的灵敏度和特异性均为100%，横向流动读数灵敏度和特异性分别为97%、100% [13]。Arizti-Sanz等[14]建立的简化突出显示感染以应对流行病的方法（streamlined highlighting of infections to navigate epidemics，SHINE）实现免样本核酸提取且将等温扩增和基于Cas13的检测融合为一步，在缩短检测时间的同时可提高灵敏度，结果可以通过管内荧光读数进行可视化并由配套的智能手机应用程序进行解读，减少污染风险。Rauch等[15]设计的坚固、精准、可扩展的基于CRISPR-Cas13a的检测方法（Cas13-based, rugged, equitable, scalable testing，CREST）将RT-PCR扩增与Cas13a酶相结合，设备只包括简易小巧的热循环仪和基于塑料过滤器的LED显像仪，特别适合现场检测，且成本低，灵敏度高。 2.2基于CRISPR-Cas12的COVID-19诊断 Cas12同样有反式切割活性，但只能靶向切割双链DNA，利用逆转录等温扩增技术可让基于CRISPR-Cas12的检测方法实现对SARS-CoV-2或其他RNA病毒的检测，原理与Cas13相似。近来张峰团队发布了更简易的SARS-CoV-2核酸检测方法STOPCovid（SHERLOCK testing in one pot）[16]，把逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）和SHERLOCK合并进行，灵敏度与qRT-PCR相当，最大优点是不需要从患者样本中提取和纯化RNA，检测SARS-CoV-2只需在一个试管中一步完成，阳性样本只需15~45 min就能获得结果，特别适于POCT场景使用。Broughton等[17]将前期建立的基于CRISPR-Cas12a的针对DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter，DETECTR）和RT-LAMP技术结合，可检测SARS-CoV-2 N和E基因。Ding等[18]设计的多合一的双CRISPR-Cas12a检测技术（all-in-one dual CRISPR-Cas12a，AIOD-CRISPR）不需要预扩增和分离扩增产物，该方法利用一对Cas12a CRISPR RNA（crRNA）复合物结合目标序列的不同位点，且不受Cas12a前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列的限制，检测结果在蓝色LED灯背景下可直接用肉眼读出。另一种基于CRISPR-Cas12a的肉眼读出检测方法（CRISPR/Cas12a-based-detection with naked eye readout，CRISPR/Cas12a-NER）利用逆转录重组酶介导等温核酸扩增技术（reverse transcript recombinase-aided amplification，RT-RAA）对SARS-CoV-2进行预扩增，结果符合率达100%[19]。另外，Zhang等[20]首次结合金纳米颗粒（gold nanoparticle，AuNP）建立了Cas12a辅助的RT-LAMP/AuNP检测（Cas12a-assisted RT-LAMP/AuNP，CLAP），该检测可同时在96孔板中进行，仅通过肉眼或普通的酶标仪就能读出结果，具有扩展到自动化检测平台的潜力，这种高通量的检测方法将很大程度地改进当前COVID-19的快速筛查工作。图1展示了几种主要的基于CRISPR-Cas12/13的COVID-19分子诊断技术原理。  

2.3基于其他CRISPR-Cas系统的COVID-19诊断 Cas9、Cas3等其他CRISPR-Cas系统虽然没有反式切割活性，无法实现游离报道分子的信号放大，但利用其靶向结合的活性同样可以准确检测出SARS-CoV-2的RNA序列。基于Cas3操作的核酸检测方法（Cas3-operated nucleic acid detection，CONAN），最快能在40 min内检测出单拷贝SARS-CoV-2 RNA[21]。Azhar等[22]首次开发出一种基于CRISPR-Cas9系统检测SARS-CoV-2的方法FELUDA（FnCas9 editor linked uniform detection assay），试剂盒已获准在印度上市销售。该法无需对报告分子进行反式切割，直接利用Cas9的酶切作用进行核酸检测，准确度与qRT-PCR检测相似，并且在检测致病性单核苷酸变异和核酸序列分析方面准确度也很高。表1列出了qRT-PCR以及各种基于CRISPR-Cas系统的SARS-CoV-2核酸检测方法的性能特征。  

/03/ 基于CRISPR-Cas系统的抗SARS-CoV-2治疗及预防策略     

3.1基于CRISPR-Cas系统的抗SARS-CoV-2治疗 已有报道证明Cas13d可被编程用于精准抑制哺乳动物体内多种单链RNA病毒而不会丢失目标基因，Cas13d具有靶向多个区域的能力且有更强的催化活性，不需要任何严格的PAM/前间区序列侧翼序列来限制切割靶点[24]，这使得CRISPR-Cas13d成为抗病毒治疗研发的热点。Abbott等[25]以CRISPR-Cas13d为基础开发了一种新技术，人类细胞中的预防性抗病毒CRISPR（prophylactic antiviral CRISPR in human cell，PAC-MAN）系统。通过对47例COVID-19和中东呼吸综合征患者的基因组序列进行比对，借助生物信息学流程建立了与人类基因组脱靶效应较小的针对高度保守的RNA依赖的RNA聚合酶和N基因的crRNA文库，在人肺上皮细胞系中PAC-MAN对SARS-CoV-2的抑制率分别为85%和70%，研究显示，PAC-MAN系统仅靠6个crRNA就足以靶向切割包括SARS、中东呼吸综合征和COVID-19相关的β冠状病毒在内的超过90%的冠状病毒基因，证明PAC-MAN可以成为一种潜在的抗SARS-CoV-2策略。然而如何安全有效地将CRISPR组件递送至人体细胞中并持续发挥作用是基于CRISPR-Cas系统的新型抗病毒治疗应用于临床的主要难题[26]。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）或慢病毒载体是病毒载体递送系统的代表，为了将Cas有效地递送到受感染细胞中，张峰团队发现了一种最小的Cas13效应蛋白Cas13bt（仅有其他Cas13蛋白的一半大小），可被直接装入单个AAV载体内进行递送[27]，Nguyen等[28]利用肺特异性AAV血清型载体将Cas13d效应蛋白和针对SARS-CoV-2 ORF1ab和S基因的特异性crRNA传递至SARS-CoV-2感染者肺上皮细胞，降解了SARS-CoV-2基因组抑制病毒复制。 另外，抗体与Cas酶融合（antibody and Cas fusion，ABACAS）技术可以通过将Cas13核酸酶与SARS-CoV-2的S蛋白特异性抗体片段融合来实现CRISPR组件的连接，ABACAS的抗体片段将识别SARS-CoV-2上的S蛋白，并促进Cas13与病毒一起选择性地递送至受感染细胞中，一旦ABACAS被传递到受感染的细胞，它就会识别并切割病毒RNA，依靠病毒本身的选择性传递也可减少组织外效应。ABACAS技术除了选择性递送CRISPR-Cas系统外，ABACAS抗体片段的中和活性还可能会干扰S蛋白和血管紧张素转化酶2受体的相互作用，并最大限度地减少病毒进入宿主细胞[29]。非病毒载体递送包括脂质纳米颗粒法、电穿孔法、核转染法、显微注射法等，其中脂质纳米颗粒法以其无毒性、低免疫原性、可增加Cas酶在体外和体内表达时间的优点脱颖而出[30]。Blanchard等[31]将合成的Cas13a mRNA和针对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的crRNA的脂质纳米聚合物通过雾化装置输送到受感染仓鼠的呼吸道，结果表明CRISPR-Cas13a可以减少仓鼠体内SARS-CoV-2的复制并减轻症状。合成的mRNA使Cas13a效应子在仓鼠体内瞬时表达，很大程度减轻了免疫应答，也减少了mRNA与受试者自身遗传物质整合的可能性。Fareh等[32]报道了一种可编程的CRISPR-pspCas13b针对SARS-CoV-2的S、N基因转录后的mRNA，抑制具有感染复制能力的SARS-CoV-2，包括猴子和人类上皮细胞中的未变异株、D614G变体和最近饱受关注的B.1.1.7变体。该研究的综合突变分析进一步证明单个crRNA对单核苷酸错配具有耐受性，并对新变种中出现的突变RNA仍保持催化活性，为开发能够抑制广大SARS-CoV-2突变体的治疗策略提供了概念验证。然而，这些研究还需要更广泛的临床前研究，还需要进一步了解其免疫原性、CRISPR组件的递送、Cas蛋白表达的时间，以及脱靶效应等问题。 

3.2基于CRISPR-Cas系统的COVID-19预防 目前已有多篇利用CRISPR-Cas9系统构建开发动物疫苗候选毒株的报道。譬如利用CRISPR-Cas9系统构建伪狂犬病病毒基因缺失的疫苗候选毒株；利用CRISPR-Cas9系统敲除非洲猪瘟病毒强毒株中的非必需基因8-DR，为后续非洲猪瘟疫苗的研制奠定基础；利用CRISPR-Cas9系统敲除毒力因子，并将异源基因插入禽类易感的疱疹病毒科传染性喉气管炎病毒基因组中，以产生多价禽疱疹病毒重组疫苗等[33]。CRISPR-Cas系统通过基因敲除、替换或插入对病毒基因组进行修饰，构建具有多种重组基因疫苗候选毒株，为人用病毒性疫苗的研究提供了一条新的有效途径。此外，应用CRISPR-Cas9系统在编辑哺乳动物细胞基因组方面的准确性，或许可以改造动物体内B细胞的基因组，使B细胞直接表达出高效价的特异性抗体以预防病毒感染。Faiq[34]提出假设，利用CRISPR-Cas9编辑B细胞基因组以表达针对不同抗原的单克隆抗体，并通过在宿主B细胞基因组中插入表达针对SARS-CoV-2抗体的核酸序列，可能在不引入病毒表面蛋白或多肽的情况下表达出抗SARS-CoV-2抗体。这将能消除重复注射的需要，同时可以在一个月内实现有效对抗某种病毒的暴发。毫无疑问，基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术为设计、研发、生产出更快速、更安全、更多价的诸如COVID-19疫苗等重组病毒疫苗提供了新的可能的技术手段。 

/04/ 小结与展望     COVID-19在世界范围内的大流行导致人类生产生活和生命健康受到严重损害，快速实时的分子诊断检测技术、切实有效的新型治疗及预防策略成为战胜全球疫情的关键。PCR和DNA测序技术的发展促进了对新发病原体的快速检测能力，成为疫情初期最有力的诊断工具。基于CRISPR-Cas系统的分子诊断技术已被证明具有灵敏、特异、快速、廉价的优点，在资源有限的地区，基于横向流动试纸条的快速检测方法可以很容易地检测SARS-CoV-2病毒核酸，大规模利用这些方法筛查受感染人群（或居家自我监测）将有助于限制病毒传播。虽然这些技术只有个别获得FDA的EUA（美国Sherlock Biosciences公司开发的SHERLOCK™ CRISPR SARS-CoV-2和Mammoth Biosciences公司的SARS-CoV-2 DETECTR™核酸检测试剂盒），但随着更多试剂研发生产企业的参与，越来越多的基于CRISPR-Cas的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒将会陆续进入临床使用，可能在不久的将来替代qRT-PCR成为分子诊断领域的主流。另外，寻找更有效的COVID-19抗病毒治疗及预防手段，也是世界各国学者目前研究的重点及难点。PAC-MAN和ABACAS是基于CRISPR-Cas系统用于COVID-19治疗中的代表性示例，只需设计出针对病毒保守序列的crRNA，就能靶向降解病毒核酸抑制病毒增殖，有助于提高未来应对变异病毒或新病毒暴发的能力。评估使用CRISPR的潜在风险对于其未来的临床应用十分重要，研发合适的传递系统以保证CRISPR的专一性、安全性和高效性，并排除脱靶效应所致突变及肿瘤的发生风险，是目前PAC-MAN等技术应用于COVID-19患者治疗急需解决的难题所在。此外，CRISPR-Cas系统应用于新型病毒性疫苗的研发，将大大缩短疫苗研发周期，为应对诸如COVID-19这类传染病的大流行提供全新的预防策略及解决方案。 

参考文献（略） 作者   刘锦嵩  鄢盛恺 遵义医科大学检验医学院，遵义 563006 

通信作者：鄢盛恺 Email：yanshengkai@sina.com 

引用本文：刘锦嵩，鄢盛恺. 针对新型冠状病毒肺炎的基于CRISPR-Cas系统分子诊断及治疗策略研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(1): 1-7.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20211102-00068

专家简介

鄢盛恺（教授/研究员，临床检验诊断学专业硕士/博士研究生导师）： 先后任中国医学科学院北京协和医院检验科主任助理、中日友好医院检验科副主任（主持工作）、遵义医科大学“候鸟人才”专家。中国计量协会医学计量专业委员会副主任委员、中国生物化学与分子生物学会脂蛋白专业委员会常务委员、中国生物工程学会临床医学工程分会委员、中国电子学会生命电子学分会委员。担任全国高等医学院校医学检验技术专业本科规划教材《临床生物化学检验》主编（医药版）及国内外十余本专业杂志编委等。主要研究方向：动脉粥样硬化的基础与临床、临床检验方法学与关键技术、医学实验室认可与评定等。已在国内外各类专业杂志上发表论文150余篇，参加编写专著42本，主编17本。主持国际合作项目、国家863项目、国家自然科学基金面上项目等6项，获省部级以上科技成果贰等奖2项次。