科研 | 郑大一附院（IF：6.684）：河南省骨质疏松症与肠道微生物的关系（国人佳作）

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种老年慢性病，我国正进入人口老龄化趋势。近年来，越来越多的证据表明益生菌可以治疗骨质疏松症。本研究旨在通过人类高通量宏基因组测序，探讨相关机制并验证其对骨质疏松症的有益作用。本研究发现，与对照组相比，一些微生物物种的丰度发生了变化，并且在OP组中发现了特定的功能通路。在种水平上，OP个体中增加的物种与骨吸收标志物呈正相关，与25-OH-D3和骨形成标志物呈负相关，其中Streptococcus sanguinis相关性最强，其次为Streptococcus gordonii、Actinomyces odontolyticus和Olsenella unclassified。此外，在OP组富集的Actinomyces graevenitzii与炎症指标呈正相关(p<0.05)，如白细胞(WBC)、中性粒细胞计数(NEC)和中性粒细胞淋巴细胞比值(NLR)。相反，对照组中Akkermansia muciniphila、Bacteroides eggerthii、Bacteroides fragilis、Bacteroides uniformis和Butyricimonas synergistic水平升高，与骨吸收标志物呈负相关，与骨形成标志物和25-OH-D3呈正相关。此外，Bacteroides fragilis与炎症指标(WBC、NEC、NLR)和上述通路呈负相关(p<0.05)。功能预测显示，OP组富集的106条代谢通路显著高于对照组(p<0.05)。OP组LPS生物合成、植酸降解、乳酸和乙醇发酵相关通路较对照组丰富，且与WBC和NEC呈正相关。综上所述，在OP个体中发现了几种丰度发生改变的物种和特定的功能通路。植酸酶在OP中的作用为阐明微生物相关的骨矿化机制提供了新的流行病学证据，值得进一步探索。

论文ID

原名：The Relationship Between Osteoporosis and Intestinal Microbes in the Henan Province of China 

译名：河南省骨质疏松症与肠道微生物的关系

期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

IF：6.684

发表时间：2021.11.18

通讯作者：丁素英

通讯作者单位：郑州大学第一附属医院体检中心

DOI号：10.3389/fcell.2021.752990

实验设计

图1 主要队列的宏基因组关联分析。(A)通过定量计算机断层摄影术(QCT)测量的原发性骨质疏松队列分析。(B)双能x线骨密度仪(DXA)测量的原发性骨质疏松队列分析。  

结果

1 受试者临床特征

总共有88名参与者参与粪便样本分析并获得临床信息。30名参与者被诊断为OP，59名骨密度正常的参与者作为对照组。训练数据集包含28名参与者(11:18)，验证数据集包含60名参与者(19:41)。与对照组相比，训练数据集OP组代谢综合征的性别、年龄、生化参数均无显著差异，说明可以排除共同原因、慢性疾病或营养因素引起的肠道微生物的影响。两组甲状旁腺激素(PTH）水平无显著差异。OP组正常范围内的甲状旁腺激素排除了继发性甲状旁腺激素所致骨质疏松。OP组的骨密度(BMD)、骨形成标志物(PINP)、瘦体重(LBM)和25-OH-D3均低于对照组(p＜0.05;表1)。然而，OP组的骨吸收标志物(β-CTX)、NEC和NLR显著高于对照组(p<0.05;表1)。

表1 OP组和对照组的骨密度(BMD)、人体成分及临床资料。

WC,腰围; BMI,身体质量指数; BMD:骨密度; FFM,去脂体重; SBP,收缩压; DBP，舒张压; FBG,空腹血糖; HbA1c,糖化血红蛋白; TC,总胆固醇; TG,甘油三酸酯; HDL,高密度脂蛋白;LDL,低密度脂蛋白; SUA,血清尿酸; WBC:白细胞; NEC,中性粒细胞计数; NLR,中性粒细胞淋巴细胞比值; PTH,甲状旁腺激素; PINP: 1型前胶原氨基端前肽; 25-OH-D3, 25-羟基维生素D3; OP,骨质疏松症。*p＜0.05具有统计学意义。

2 肠道菌群多样性分析

对29份粪便样品进行宏基因组分析，根据与参考数据库中最接近的序列比对，将序列划分为门和属。我们利用STAMP分析了不同水平的微生物群(门到属)，发现OP组与对照组间有1科2属存在差异(p<0.05;图2A)。在门和种水平上无显著差异。

通过Shannon和Gini指数衡量微生物多样性，OP组和对照组的微生物α多样性水平非常相似(p=0.808和p=0.912)（图2B）。通过计算Hellinger、Jensen Shannon divergence(JSD)、Bray和Spearmen距离，比较OP组和对照组的物种水平beta多样性。该分析表明，OP组和对照组的物种水平beta多样性没有显著差异(分别为p=0.674,p=0.707,p=0.774, p=0.055;图2A-F)。

图2 骨质疏松症(OP)组与对照组肠道菌群组成。(A)与对照组相比，OP组Porphyromonadaceae、Parabacterodies和Parapreotella的相对丰度降低(p＜0.05)。与对照组相比，OP组的菌门无显著差异(p＞0.05)。(B)微生物α多样性通过Shannon和Gini指标进行衡量，用于比较OP组和对照组。(C-F) OP组与对照组间的Beta多样性。Beta多样性采用Hellinger、Jensen Shannon divergence (JSD)、Bray和Spearmen距离计算。OP组与对照组无显著差异。

2 肠道菌群组成、及其与临床特征的相关性分析

2.1 肠道菌群组成分析

与对照组相比，OP组鉴定出20种丰度差异显著的物种。去除出现率和丰度较低的物种后，仍然存在14个丰度差异显著的物种(p<0.05;图3A)，这表明OP组肠道微生物群的组成发生了改变。其中，OP组中嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、Bacteroides uniformis和Butyricimonas synergistic水平降低，而Actinomyces graevenitzii、Actinomyces sodontolyticus、Olsenella unclassified、Pantoea unclassified、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、Streptococcus mitis oralis pneumoniae、副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)和病原菌(如大肠杆菌Escherichia coli)丰度增加(p<0.05;图3A)。

 图3 OP组与对照组细菌种类的相对丰度，以及肠道菌群丰度与临床指标的关系。(A)Wilcoxon检验用于分析细菌物种的相对丰度，结果显示14个物种之间存在显著差异，其中5个在对照组中富集，9个在OP组中富集(p<0.05)。(B)物种和临床参数的相关矩阵。黄色和红色表示正相关，而蓝色表示负相关。带有星号的单元格表示p<0.05。

2.2 肠道菌群丰度与骨密度测量或炎症水平、骨代谢标志物之间的相关性

采用Spearman相关分析方法探讨物种丰度与临床参数的相关性。我们发现，对照组中埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)的含量较高，且与骨密度(BMD)呈正相关(r=0.378, p<0.05;图3B)。此外，我们还分析了肠道菌群与炎症水平或骨代谢标志物之间的相关性。结果发现，对照组中富集的5种物种均与骨形成标志物(PINP)和25-OH-D3呈正相关，与骨吸收标志物(β-CTX)呈负相关，其中Akkermansia muciniphila和Bacteroides eggerthii相关性最强，其次是Butyricimonas synergistic、Bacteroides fragilis和Bacteroides uniformis。此外，对照组中5种富集物种均与WBC、NEC和NLR呈负相关，其中Bacteroides fragilis与WBC和NEC的相关性最强(r=-0.313, -0.348, p<0.05;图3B)。

OP组富集的4种物种与β-CTX呈正相关，与PINP和25-OH-D3呈负相关，其中与Streptococcus sanguinis相关性最强，其次是Streptococcus gordonii、Actinomyces odontolyticus和Olsenella unclassified。在OP组富集的Actinomyces graevenitzii与WBC、NEC和NLR的正相关性最强(r=0.435, 0.532, 0.305, p<0.05; 图3B)。所有具体相关性见附表S1。

3 不同参与者的微生物组特征的功能变化以及功能变化与骨密度或临床特征的关系

3.1 微生物组特征的功能变化分析

我们使用微生物MetaCyc通路构建了每个样品的功能概况。去除低丰度通路后，发现OP组富集的106条MetaCyc通路显著高于对照组(p<0.05;图4A)。与对照组相比，OP组多糖降解、脂质代谢、TCA循环和氨基酸生物合成或利用的相关通路丰度约为44.3%。其中，在OP参与者中富集的47.1%的通路与辅因子、载体、维生素和铁载体以及金属团的生物合成有关(这些通路主要参与氧化还原反应和TCA循环)。重要的是，有三条通路负责混合酸发酵、同型乳酸发酵和异型乳酸发酵(前体代谢产物发酵是指糖，如葡萄糖、果糖和蔗糖，转化为细胞能量和代谢副产物乳酸和乙醇的过程)。PWY-4702负责植酸降解并释放磷酸盐。5条通路(PWY0-1338、PWY0-1241、PWY-7315、KDO-NAGLIPASYN-PWY和ECASYN-PWY)负责脂多糖(LPS)的合成。

图4 OP组和对照组之间细菌种类的功能变化，以及功能变化与骨密度或炎症水平的关系。(A)细菌种类的功能变化。健康对照组和OP组之间具有不同丰度的MetaCyc通路(p<0.05，Wilcoxon秩和检验)。(B)OP相关通路与BMD测量值或炎症水平的Spearman相关矩阵。蓝色表示负相关，而黄色和红色表示正相关。带有星号的单元格表示p<0.05。

3.2 微生物组功能变化与BMD或炎症水平和骨代谢标志物之间的相关性

两组之间的大部分通路负责糖脂和氨基酸的代谢。因此，我们专注于临床指标与炎症、短链脂肪酸和植酸酶的功能通路之间的相关性。除PWY-922、FERMENTATION-PWY和PWY-7392外，共有104条OP富集途径与WBC和NEC呈正相关(图4B)。特别是，这些通路包括负责LPS生物合成的通路(KDO-NAGLIPASYN-PWY、ECASYN-PWY、PWY0-1338、PWY0-1241和PWY-7315)。相反，FERMENTATION-PWY与炎症指标(WBC、NEC)呈负相关。此外，PWY-4702与BMD、25-OH-D3和骨形成标志物(PINP)呈正相关，与β-CTX呈负相关(r=0.0.311, 0.419, 0.337, -0.357, p<0.05;图4B)。

4 功能变化与微生物群特性的关系

用Spearman相关分析方法探讨了物种丰度与功能变化之间的关系。负责植酸降解、LPS生物合成、乳酸和乙醇发酵的通路与在OP组富集的Actinomyces graevenitzii、Actinomyces odontolyticus、Escherichia coli和Pantoea unclassified均呈正相关(p<0.05;图5)。所有具体的相关关系见补充表S2。

图5 微生物通路和物种的Spearman相关矩阵。蓝色表示负相关，黄色和红色表示正相关。带有星号的单元格表示p<0.05。

5 肠道菌群预测骨质疏松模型的建立及验证

为建立简单的OP无创模型，训练数据集纳入28名参与者(11:18)，测试数据集纳入60名参与者(17:41)。进一步采用多因素logistic回归方法建立预测模型，结果显示，在训练数据集中有3个物种(Streptococcus sanguinis、Akkermansia muciniphila和Bacteroides eggerthii)是OP的影响因素(图6)。模型1在训练和测试数据集中的受试者工作曲线下面积(AUC)分别为0.818和0.717。此外，通过分析肠道微生物组与临床特征之间的相关性，构建了操作模型2，其中包括6个物种（Actinomyces graevenitzii、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus sanguinis、Akkermansia muciniphila、Bacteroides Eggerthii和Butyricimonas synergistica）。模型2在训练和测试数据集中的AUC分别为0.848和0.725，高于模型1(图6)。

图6 肠道菌群预测OP的模型建立及验证。受试者工作特征(ROC)曲线用于预测训练和测试数据集中的OP。红线表示模型1（Streptococcus sanguinis、Akkermansia muciniphila和Bacteroides egerthii）基于多因素logistic回归分析的ROC曲线。蓝色线表示模型2(Actinomyces graevenitzii、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus sanguinis、Akkermansia muciniphila、Bacteroides eggerthii和Butyricimonas synergistica)的ROC曲线。

讨论

本研究通过宏基因组测序研究了中国河南省一个OP队列的肠道菌群组成和功能关系的具体变化。迄今为止，肠道微生物影响骨密度(BMD)的潜在机制仍不清楚。然而，我们发现了肠道微生物的组成和功能与OP之间潜在的和有趣的关系。在物种水平上，Actinomyces graevenitzii、Actinomyces sodontolyticus、Olsenella unclassified、Pantoea unclassified、Streptococcus gordonii、Streptococcus Mitis portalis pneumoniae、Streptococcus parasanguinis和Streptococcus sanguinis在OP组中富集，而Akkermansia muciniphila、Bacteroides eggerthii、Bacteroides fragilis、Bacteroides uniformis和Butyricimonas synergistic在对照组中富集，Bacteroides egerthii与炎症参数呈负相关，与BMD呈最强正相关。相反，OP富集的物种与骨吸收标志物呈正相关，与25-OH-D3和骨形成标志物呈负相关。此外，LPS生物合成通路与炎症参数及OP组富集的物种呈正相关，与对照组富集的物种呈负相关，表明LPS参与骨代谢。

其中，在OP组富集的Streptococcus sanguinis和Actinomyces odontolyticus与骨吸收标志物(β-CTX)呈正相关，与骨形成标志物PINP和25-OH-D3呈负相关。OP组放线菌属(Actinomyces)诱导双膦酸盐相关颌骨OP的骨破坏，抗菌治疗可能会导致更好的临床结果，这表明放线菌可能参与炎症，导致随后的骨坏死。此外，Streptococcus sanguinis具有骨吸收活性，通过抑制Runx2表达增加破骨细胞分化，减少成骨细胞。这与我们的研究结果一致，OP组炎症水平较高，且OP组富集的物种与WBC、NEC、NLR呈正相关，尤其是Actinomyces graevenitzii。因此，我们认为在OP组富集的细菌是通过介导炎症引起OP的。此外，功能遗传分析显示，与对照组相比，OP组负责TCA循环、糖醛酸、脂质和氨基酸代谢以及氧化还原反应的通路数量更多。特别是LPS生物合成通路与NEC和OP组中富集的Actinomyces graevenitzii、Actinomyces odontolyticus、Escherichia coli和Pantoea unclassified呈正相关，表明肠道菌群在引起轻度炎症中发挥作用。LPS通过影响破骨细胞增殖、下调骨保护素、上调破骨细胞因子(肠黏膜完整性受损、肠通透性增加)诱导骨丢失，从而间接诱导炎症反应，增加TNF-α、IL-1和INF-γ水平。因此，我们推断，肠道微生物群产生的过多LPS可能通过炎症相关通路导致骨矿物质流失。

嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)通过增加抗炎IL-10和减少抗炎IL-12介导的降低肠通透性和抑制全身炎症细胞浸润，从而恢复骨破坏并改善骨折后血管重建。此外，Akkermansia muciniphila还能增加TIGK细胞中连接完整性标志物的表达，如整合素β1、E-cadherin和ZO-1。与我们的结果一致，我们观察到OP组中Akkermansia muciniphila和Bacteroides eggerthii的水平降低，其与骨吸收标志物β-CTX呈负相关，与骨形成标志物PINP和25-OH-D3呈正相关。此外，与BMD呈正相关的Bacteroides eggerthii能增强小鼠后代的先天性免疫和适应性免疫，减轻过敏原诱导的气道炎症。随着慢性肾脏疾病的进展，Bacteroides eggerthii的水平逐渐降低，说明Bacteroides eggerthii对早期诊断具有特殊的价值。因此，我们推测，Bacteroides eggerthii通过参与肾脏中25-OH-D3的合成而导致OP。值得注意的是，OP组的Butyricimonas synergistic水平降低。Butyricimonas synergistica是一种产生丁酸/SCFA的细菌，可减少LPS的产生，这表明通过补充EPA/DHA增加Butyricimonas synergistica可通过上调葡萄糖转运蛋白4和Akt磷酸化水平来减轻脂肪炎症，表明改善了胰岛素信号传导。此外，功能基因分析显示，OP组富集的通路与乳酸发酵有关，从而降低了SCFAs水平。炎症系统对于正常的骨重塑和骨丢失的开始至关重要。因此，我们推测，SCFA产生菌的减少促进了脂多糖产生菌的增殖，增加了肠道通透性，导致慢性轻度全身炎症。SCFAs抑制间充质前体细胞的Wnt10b信号，刺激成骨细胞的产生，抑制脂肪细胞的产生。

有趣的是，PWY-4702负责植酸降解。植酸是最丰富的肌醇磷酸盐。植酸盐可能与矿物质和蛋白质形成非常稳定的复合物，这使得这种分子具有“臭名昭著”的抗营养特性，这表明它能够螯合矿物阳离子，从而影响矿物吸收。植酸盐的降解是通过一组叫做植酸酶的酶来实现的，这些酶能够从植酸盐中逐步释放磷酸盐。最终，植酸酶通过增加植酸中螯合矿物质的可用性，提高了磷酸盐的利用，进而提高了植物性食品的营养价值。然而，人类和单胃动物的消化道中缺乏水解植酸酶。这与我们在OP组发现PWY-4702的富集是一致的。为了响应OP患者的代偿性骨代谢，负责释放磷酸盐的通路被肠道微生物增加。该通路与骨形成指标正相关，与骨吸收指标负相关，进一步说明该通路在物种中参与了对骨形成的补偿作用。值得注意的是，先前的一项研究表明，在猪饲料中添加微生物植酸酶可以提高磷消化率和骨矿化，减少粪便中磷的排泄。因此，植酸产生菌可能会促进骨吸收。

结论

本研究存在几个局限性。样本量较小，验证数据集的骨密度(BMD)采用DXA测量。我们也没有收集一些生活方式方面的信息，比如日照时间和锻炼方式。然而，本研究发现中国患者肠道菌群组成和功能与OP相关的广泛而有趣的变化，其特征是放线菌(Actinomyces)和链球菌(Streptococcus)水平升高，Akkermansia、Bacteroides和Butyricimonas synergistic水平下降，以及几种功能通路的改变。特别是，骨吸收可能被植酸酶产生菌抑制并促进骨形成。此外，模型2较高的AUC表明，补充益生菌（Akkermansia muciniphila、Bacteroides egerthii和Butyricimonas synergisti）可能会改善骨代谢，这需要验证其对OP的治疗效果，同时避免药物相关的副作用。