慢性神经病理性疼痛小鼠空间记忆损伤及其海马转录组学特征

邹李静1 丁豪2 郁丽娜2 严敏1,2

1徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室，徐州 221004；2浙江大学医学院附属第二医院麻醉科，杭州310016

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(01):6-12.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210528‑00450

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【论著】

本研究通过神经病理性疼痛模型观察慢性疼痛对小鼠空间记忆的影响，并采用转录组学测序和实时荧光定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）方法分析并验证慢性神经病理性疼痛小鼠海马基因表达的变化，以期系统分析海马如何参与慢性神经病理性疼痛所致空间记忆障碍的机制，为临床治疗提供新的思路和方法。

1 材料与方法      

24只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为两组：假手术组（Sham组）、坐骨神经慢性缩窄性损伤（CCI）组（CCI组），每组12只。

分别于术前、术后7 d、术后28 d采用Von Frey纤维丝实验检测小鼠机械刺激缩足阈值（PWMT）；在术后7、28 d通过旷场实验检测小鼠运动能力和焦虑状况，通过空间位置识别实验检测小鼠空间记忆；于术后28 d取新鲜海马组织进行转录组学测序检测两组小鼠基因表达差异并分析测序结果，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）验证纤调蛋白（FMOD）、骨形态发生蛋白7（Bmp7）、前列腺素D2合成酶（PTGDS）、醛脱氢酶1家族成员A2（Aldh1a2）四组基因表达情况。引物由上海生工生物科技有限公司合成及提供，如表1所示。

2 结 果     

2.1　两组小鼠PWMT及行为学比较

两组小鼠术前PWMT基本维持在同一水平，差异无统计学意义（P=0.227）；与Sham组比较，CCI组小鼠术后7 d PWMT明显降低（t=6.01，P<0.001），且可维持至术后28 d（t=4.49，P<0.001）。见图1。

术后7、28 d，两组小鼠旷场实验运动距离比较，差异没有统计学意义（术后7 d t=0.25，P=0.962，术后28 d t=0.32，P=0.939）；旷场中心区域活动时间比较，两组差异也无统计学意义（术后7 d t=1.16，P=0.439，术后28 d t=0.34，P=0.931）。见图2。

与Sham组比较，CCI组小鼠术后7 d对改变位置后的物块探索时间差异无统计学意义（t=2.00，P=0.101），但术后28 d探索时间则明显降低（t=2.93，P=0.011）。见图3。

2.2　转录组学测序结果分析差异表达基因（DEGs）

两组小鼠海马转录组学测序结果共展示了54 332个基因，其中有217个DEGs。与Sham组比较，CCI组小鼠海马DEGs包含74个表达上调基因和143个表达下调基因。DEGs详情见表2。

对DEGs进行基因本体（GO）富集分析发现，表达前3位的差异类别均在细胞组成部分，包括细胞外基质、蛋白质细胞外基质以及粗面内质网。相关DEGs详见表3。

通过京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库分析DEGs主要涉及的信号通路发现，表达上调基因的前3位富集通路是涉及丙型肝炎、麻疹、甲型流感3种疾病机制的信号通路，而表达下调基因的前3位富集通路则是关于细胞外基质受体相互作用、胆碱能突触、蛋白的消化和吸收过程的信号通路。表4详细列举了差异上调基因和差异下调基因各自前10位富集的信号通路。

2.3　两组小鼠RT‑qPCR验证DEGs比较

从前10位表达下调基因中筛选部分基因进行RT‑qPCR验证发现，与Sham组比较，CCI组小鼠海马组织中FMOD（t=8.07，P<0.001）、Bmp7（t=4.81，P=0.003）、PTGDS（t=4.07，P=0.007）、Aldh1a2（t=7.93，P<0.001）基因表达均降低（图4）。

3 讨 论      

本研究团队猜测海马可能在慢性神经病理性疼痛所致空间记忆障碍中发挥着作用。目前已有部分研究证明海马参与调控慢性疼痛所致空间记忆障碍，但该方面研究较少，仍需进一步探究。

本研究采用CCI手术构建神经病理性疼痛模型，并通过行为学实验检测小鼠的空间记忆能力。研究发现CCI组小鼠在术后7 d PWMT显著降低，且可持续至术后28 d；通过旷场实验发现两组小鼠在旷场中的运动能力、焦虑状况差异没有统计学意义，可见CCI组小鼠探索能力不会受到显著影响；通过空间位置识别实验发现，CCI小鼠术后28 d对改变位置后的物块探索时间显著降低，提示小鼠忘记物块原位置，没有对新位置的物块表现出探索欲，说明小鼠出现空间记忆障碍。该实验说明慢性神经病理性疼痛可并发空间记忆障碍，与临床现象相吻合。

为进一步探究海马在慢性神经病理性疼痛并发空间记忆障碍中的作用，本研究采用转录组学测序的方法全面分析CCI组小鼠海马组织的DEGs，其中包括74个表达上调基因和143个表达下调基因。同时对DEGs进行GO富集分析，研究其本体功能（包含生物过程、细胞组成及分子功能），以初步判断CCI组小鼠海马的功能改变。结果发现DEGs尤其是表达下调基因主要影响海马的细胞外基质和蛋白的细胞外基质功能。为进一步探究DEGs的信号通路及其联系，本研究还分别对表达上调基因和表达下调基因进行了KEGG分析。

DEGs的GO分析和KEGG分析均提示海马细胞外基质相关的表达下调基因可能参与到慢性神经病理性疼痛所致空间记忆障碍的机制中，进一步证实了海马参与调控神经病理性疼痛小鼠的空间记忆能力。目前已有研究发现细胞外基质的结构和生化可塑性改变可导致工作记忆缺陷，且已有部分基因被证明参与海马记忆过程，如Slc13a4基因缺陷小鼠学习和记忆能力下降以及Bmp7信号通路可影响海马齿状回的神经发生。本研究采用RT‑qPCR方法验证了部分表达下调基因的mRNA水平，发现CCI组小鼠海马FMOD、Bmp7、PTGDS、Aldh1a2四组基因表达均显著降低，亦提示海马细胞外基质相关的表达下调基因可能参与调控神经病理性疼痛所致空间记忆障碍。

本研究结果显示，神经病理性疼痛所致空间记忆障碍小鼠的海马组织出现基因表达差异，且初步发现神经病理性疼痛所致空间记忆障碍小鼠海马细胞外基质的相关基因mRNA水平表达降低，进一步提示海马在该疾病中可能发挥着重要的作用。但这些表达下调基因是如何发挥作用进而影响神经病理性疼痛所致空间记忆障碍的机制尚不清晰，有待于进一步研究。综上所述，本研究将为研究海马与慢性疼痛所致认知障碍提供更多差异基因数据，为研究慢性疼痛所致记忆障碍提供更多的思路。