阴沟肠杆菌：CaOx 结石病的恶棍？

Enterobacter cloacae: a villain in CaOx stone disease?

Yuanyuan Yang, Senyuan Hong, Jinzhou Xu, Cong Li, Shaogang Wang & Yang Xun Urolithiasis (2022)Cite this article192 AccessesMetrics

      为了探索尿路微生物组在草酸钙结石（CaOx）形成中的作用，我们收集了单侧CaOx结石患者的两侧肾盂尿液，根据严格的标准招募了单侧CaOx结石患者。将16S rRNA基因测序应用于每对肾盂尿液。对泄殖肠杆菌进行细菌基因组测序，并应用生物信息学分析，探讨泄殖腔肠杆菌诱导CaOx结石形成的可能途径。进行了体内实验以验证我们的说法，将Von Kossa染色，TUNEL测定和蛋白质印迹应用于SD大鼠，探索结石形成的机制。发现结石一侧和非结石一侧肾盂尿液之间有26种明显不同的细菌，其中泄殖腔肠杆菌排名最为不同。泄殖肠杆菌的细菌基因组测序显示，其毒力因子包括鞭毛蛋白、LPS和Fimbrial。GO和KEGG分析显示，它可能通过离子暴饮暴食和信号转导途径诱导CaOx结石的形成。动物实验结果表明，与对照组相比，乙醛酸可以促进肾脏的凋亡和晶体沉积，而预先注射阴沟肠杆菌显然可以增强效果。虽然Western Blot表明乙醛酸或肠杆菌泄殖腔可以增加IL-6，Mcp-1，BMP2和OPN在大鼠肾脏中的表达，但乙醛酸和肠杆菌泄殖腔一起可以加剧这些增加。这些发现表明，泄殖腔肠杆菌可能在CaOx结石形成中起重要作用。然而，这项研究只是一个初步的探索。还需要进行进一步的研究。

      肾结石是一种常见疾病，发病率高，复发率高。结石形成的患病率和复发率在世界范围内呈上升趋势[1]。在中国，肾结石的患病率估计为5.8%，其中男性为6.5%，女性为5.1%[2]。肾结石的复发可造成严重损害，甚至肾功能衰竭，给个人和社会带来沉重的经济和健康负担[3]。最近，器械小型化大大提高了肾结石的手术治疗。然而，药物治疗和预防并未得到实质性改善，因为结石形成的机制尚不清楚[4]。约80%的肾结石由CaOx晶体与不同量的磷酸钙（CaP）混合而成[5]。高草酸盐尿被认为是一个关键的危险因素[6]，而尿钙通常正常或短暂性高[7]。到目前为止，CaOx结石是如何形成的仍然不清楚。以前的研究集中在系统因素上，如代谢或遗传问题[8]。然而，临床观察和文献报告都表明，大多数CaOx结石患者有单侧病灶[9]。所有这些都不能用系统因素来解释。因此，肾脏中可能有一些局部因素诱导CaOx结石的形成。

        从历史上看，人们普遍认为，尿液微生物群与感染性结石的形成密切相关，细菌可以通过脲酶促进鸟粪石结石的形成[10]。最近，随着16S rRNA基因测序的快速发展，微生物组的检测得到了广泛的改进[11]。因此，越来越多的证据表明，细菌与肾结石的相关性更广泛，不仅是传染性结石，还有CaOx结石[12，13]。Ryan等人从CaOx结石患者的尿液和结石中分离并纯化了大肠杆菌和表皮葡萄球菌，提示草酸钙结石的形成可能与泌尿微生物群有关[14]。然而，本研究中的尿液样本是从不同患者的膀胱中收集的，这不能消除全身因素的影响，例如遗传和新陈代谢因素。

       为了消除代谢和遗传异常的影响，我们招募了单侧CaOx结石患者，并收集了他们的两侧（结石侧和非结石侧）肾盂尿液。我们应用16S rRNA基因测序来检测同一患者肾盂尿液结石侧和非结石侧肾盂尿液之间微生物群的差异。进行了体内实验，初步探索了微生物群与CaOx结石之间的关系。这项研究首次尝试揭示同一患者结石侧和非结石侧之间肾盂尿液的不同微生物群，试图揭示尿微生物群与CaOx结石之间的关系。

方法

参与者的信息和尿液样本收集

患者来到我们科室，通过计算机断层扫描预测的疑似单侧CaOx结石被邀请参加研究。排除标准包括4周前的抗生素暴露，血尿或其他器质性疾病。所有患者均接受经皮肾碎石切开术。在经皮肾石切开术时收集来自每个参与者的盆腔尿液，静脉注射呋塞米后，肾盂尿液通过输尿管导管直接收集在无菌管中。我们收集了结石两侧和非结石侧的骨盆尿液。样品立即在液氮中冷冻，随后储存在-80°C下。整个过程通过MICROCOSM（尿结石疾病微生物组国际联盟）的指示保持无菌[15]。经结石组成分析后，选取CaOx结石确诊明确的患者尿液样本，并应用16S rRNA基因测序。样品处理和数据分析部分也遵循了联盟的指示，以尽量减少与微生物组研究相关的技术偏差和障碍。华中科技大学同济医学院同济医院伦理审查委员会已批准采集肾盂尿液样本（2021S130）。从每个参与者那里获得知情同意。

分离和纯化

使用溶血杆菌分离琼脂（SoleyBio，北京，QP0382）从我们研究中招募的患者的骨盆尿液中收集肠杆菌泄殖腔分离物。全基因组测序（WGS）用于确认泄殖腔肠杆菌并探索其特征。

16S rRNA基因测序和全基因组测序（WGS）

使用OMEGA土壤DNA试剂盒（D5625-01）（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA）提取总基因组DNA，并在进一步分析之前储存在−20°C。使用前向引物27F（5'-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3'）和反向引物1492R（5'-ACCTTGTTACGACTT-3'）对近乎全长的细菌16S rRNA基因进行PCR扩增。提取的DNA扩增通过两步PCR进行，在第二步PCR中将样品特异性16-bp条形码掺入正向和反向引物中。定量后，扩增子以等量汇集，并使用PacBio Sequel平台进行单分子实时（SMRT）测序。原始序列是通过PacBio SMRT Link门户（版本5.0.1.9585）阐述的。使用QIIME2进行微生物组生物信息学研究（https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/）[16]。使用DADA2插件[17]对原始序列数据进行去多路复用，并对质量进行过滤，去噪声，合并和删除嵌合体。分类学被分配到扩增子序列变体（ASV），使用特征分类器插件中的分类 - sklearn朴素贝叶斯分类分类器，针对SILVA Release 132数据库[18，19]。

Bioinformatics and statistical analysis

序列分析主要使用QIIME2和R包（v3.2.0）进行。使用QIIME2中的ASV表计算了Chao1，Simpson指数，Shannon指数，Pielou均匀度，观察到的物种，Faith的PD和Good的覆盖率等阿尔法多样性指数，并可视化为箱形图。进行β多样性分析，以使用未加权的uniFrac距离指标[20]，可视化为主坐标分析（PCoA）并通过Adonis测试进行评估，以探索Hea和Lith组微生物群落的结构变异[21]。生成维恩图是为了通过R包"维恩图"可视化Hea组和Lith组之间常见和独特的ASV[22]。线性判别分析效应量（LEfSe）分析用于鉴定Hea组和Lith组之间的差异丰富细菌，临界值为2.0。PICRUSt2包用于进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径分析，基因本体分析和Metacic途径分析。

动物实验设计

从华中科技大学同济医学院同济医院实验动物中心购买了12只雄性SD大鼠（8周龄，300克）。所有程序均由华中科技大学同济医学院同济医院动物护理与使用委员会批准。将大鼠在特定的无病原体动物体内适应12小时光/暗循环的环境1周。将大鼠随机分为以下4组，每组3只大鼠：对照组;乙醛酸组，腹膜内注射乙醛酸（10.5mg / ml，6.66ml / kg，MackLin，上海）每天九天;泄殖腔肠杆菌组，肾盂注射泄殖腔肠杆菌（2*108cfu/毫升，50微升）;乙醛酸+泄殖腔肠杆菌组，肾盂注射泄殖腔肠杆菌（2*108cfu / ml，50 ul），然后腹膜内注射乙醛酸（10.5mg / ml，6.66 ml / kg，MackLin，上海）每天九天。所有大鼠在上述治疗后均被安乐死2周。收集肾组织，用4%多聚甲醛固定或在-80°C下冷冻以进一步使用。

通过冯·科萨染色检测晶体沉积，并通过TUNEL测定细胞凋亡按照制造商的说明（Vazyme），用TUNEL测定法评估肾组织的凋亡。使用BX53荧光显微镜拍摄图像（奥林巴斯，东京，日本）。根据制造商的说明，通过Von Kossa染色分析肾脏中的晶体沉积（Solarbio，北京）。通过显微镜观察染色的组织（奥林巴斯，日本）。

蛋白质印迹分析

在RIPA裂解缓冲液中用蛋白酶抑制剂苯基甲烷磺酰氟（PMSF）和磷酸蛋白酶抑制剂（百洋泰生物技术，中国上海）切割并裂解肾组织。使用联新可宁酸（BCA）蛋白质测定试剂盒（中国上海百洋泰生物科技）测量蛋白质浓度。使用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和分离蛋白质，5%和12%120 V，2小时，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上200mA，70分钟（MCP-1，IL-6）和200 ma，90分钟（BMP2，OPN）。用5%牛血清白蛋白阻断PVDF膜2 h。将膜与针对BMP2（proteintech组，66，383–1-Ig，中国，1：1500），OPN（Boster，PB0589，中国，1：1000），IL-6（Boster，BA4399，中国，1：1000），MCP-1（proteintech，66，272–1-Ig，中国，1：1500），β-肌动蛋白（proteintech，66，009-1-Ig，中国，1：4000）的一抗在4°C过夜。然后将它们在室温下与二抗一起孵育2小时，使用增强显影剂（Boster，中国）可视化蛋白质。用image-pro plus分析了这些蛋白质的灰度值。所有WB定量均使用三个独立的蛋白质印迹结果。

结果

CaOx结石患者的一般特征

单侧CaOx结石患者参与了这项研究。最后，我们根据严格的纳入标准，将4名患者，即8个样本纳入我们的研究。参与者的详细信息列于表1中。这些肾结石主要由草酸钙组成。这些参与者的钙浓度正常。将16S rRNA基因测序应用于每个参与者的结石侧和非结石侧骨盆尿液，以消除代谢和遗传因素等全身因素。表1 本研究纳入的患者基本信息

     将来自每个参与者两侧的骨盆尿液应用于16S rRNA基因测序分析。从这8个样品中共获得103，198个高质量序列，平均长度为1462个。所有序列均聚集成1027个ASV，属于794属和58个门。Kruskal-Wallis测试表明，包括Chao1，Simpson，Shannon和观察到的物种在内的α多样性指数表明栖息地内多样性没有显着差异（图1a）。ASV水平的PCoA表明，Lith（石头侧）和Hea（非石头侧）组的整体微生物群组成不同，换句话说，栖息地间的多样性不同，这得到了阿多尼斯试验（P < 0.01）的证实（图1b）。

图 1

       肾盂尿液微生物群在结石侧面和非结石侧面的丰富性和多样性。a 骨盆尿液微生物群α多样性在非结石侧（Hea）和结石侧（Lith）之间的比较。通过Kruskal-Wallis测试，Chao1，Shannon，Simpson，Pielou_e，观察到的物种，Faith_pd和商品覆盖指数在扩增子序列变异（ASV）水平上比较了非石侧（Hea）和石侧（Lith）。b 骨盆尿液微生物群β多样性在非结石侧（Hea）和结石侧（Lith）的比较。Beta多样性通过基于未加权单一的PCoA进行，基于ASV水平的二元皮尔逊距离的PCoA散点图揭示了非石材侧面和结石侧的分类

单侧CaOx结石患者结石侧和非结石侧微生物群组成的分类学分析

     维恩图显示，Lith和Hea组共享只有138个（8.16%）ASV，仅在Lith组中发现了1228个（72.62%）ASV，仅在Hea组中发现了325个（19.22%）（图2a）。ASV的分类学分配揭示了细菌种群的组成，直至门和属水平。在门水平上，变形杆菌是Lith组中最常见的细菌，其次是Firmicutes。在属水平上，Lith组的常见细菌是假单胞菌，不动杆菌，克雷伯氏菌和Escherichia（图2b）。LDA效应大小分析（LEfSe）显示了样本群落中主要分类单元从门到物种（从内环到外环）的分类层次结构关系。从这个分支图中，我们发现11种细菌在物种水平上稳定地富含Lith组，这可能在CaOx结石中起重要作用（图2c）。为了进一步比较各样品中物种组成的差异，并显示每个样品中物种丰度的分布趋势，我们使用热图进行物种组成分析。根据筛选细菌（P <0.05），我们在物种水平上鉴定出26种最显着不同的细菌。这26种细菌的详细信息显示在表2中。 在这些失调的细菌中，泄殖肠杆菌和白蜈杆菌是单侧CaOx结石患者肾盂尿液结石侧最稳定的上调细菌（图3a）。我们可以通过不同组的直方图了解每个样品的泄殖肠杆菌和白蜀菌属的特定丰度（图3b）。

图 2

单侧CaOx结石患者结石侧和非结石侧微生物群组成的分类学分析。a 共发现骨盆尿液中有1691个细菌，其中1228个在结石侧发现，325个在非结石侧发现。b Hea和Lith组微生物群在门或属水平上的组成。c 支链图显示了样本群落中主要分类单元从门到种（从内环到外环）的分类等级关系。节点大小对应于分类单元的平均相对丰度，空心节点表示组间无显著差异的分类单元，而实心节点表示组间显著

表2 26种显著不同菌的基本信息

图 3 

非结石侧（Hea）和结石侧（Lith）之间的不同细菌。a 根据p<0.05的筛选标准，发现26种细菌在两侧差异最大。红蓝色光谱的尺度代表了零均值归一化（Z评分）后的丰度。b 肾盂两侧（Lith）和非结石侧（Hea）的肾盂尿液中泄殖肠杆菌和白蜀杆菌属的相对丰度。y轴的尺度是原始相对丰度乘以1，000，000以包括一些非常低的丰度

肾盂尿液微生物群的功能

为了探索来自肾盂尿液样本的细菌的可能生物学功能，我们进行了KEGG途径分析（图4a）。结果表明，最丰富的通路与细胞过程（细胞运动），环境信息处理（膜转运和信号转导），遗传信息处理（复制和修复），人类疾病（传染病），代谢和有机体系统（环境适应和免疫系统）有关。MetaCyc通路表明，雄烯二酮降解富集在Lith基团（结石侧）中，并且主要的失调细菌是假单胞菌（图4b）。

图 4

肾盂尿液微生物群的生物信息学分析。a KEGG通路分析结石侧和非结石侧的骨盆尿液。x 轴的单位是 KO/1，000，000。b 结石侧和非结石侧骨盆中钙质结石患者尿的不同MetaCyc通路

   从肾盂尿液中分离和纯化的泄殖肠杆菌的全基因组测序（WGS）

为了进一步探索泄殖肠杆菌，我们对从肾盂尿液中分离和纯化的肠杆菌泄殖腔进行了全基因组测序。基因组图对泄殖腔肠杆菌进行了全面观察，包括质粒和染色质（图5）。此外，我们进行了GO和KEGG分析，以找到泄殖肠杆菌用于促进结石形成的可能途径。生物信息学结果表明，离子结合和信号转导途径丰富。鉴于CaOx结石与钙离子和信号转导密切相关，泄殖腔肠杆菌可能是CaOx结石形成的可能突破（图6）。更重要的是，我们探索了泄殖肠杆菌的可能毒力因子，发现与鞭毛相关的蛋白质是主要因素（表3）。

图 5

泄殖腔肠杆菌的基因组图。a 染色体的基因组图。b 质粒的基因组图。从内到外，第一个圆圈代表比例;第二个圆圈表示GC歪斜;第三个圆圈代表GC内容;第四和第七个圆圈代表每个CDS所属的COG;第五和第六环代表CDS，tRNA和rRNA在基因组上的位置

图 6

泄殖腔肠杆菌的生物信息学分析。a 泄殖腔肠杆菌基因肿瘤学分析。b 泄殖腔肠杆菌的KEGG通路分析

表3 泄殖腔肠杆菌的毒力因子

泄殖沟肠杆菌对晶体沉积和凋亡的影响

使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP Nick-End标记（TUNEL）测定评估细胞凋亡。大鼠将乙醛酸与预注射的肠杆菌泄殖腔注射到肾盂中比仅注射乙醛酸或泄殖肠杆菌的大鼠表达更严重的细胞凋亡（图7a）。此外，使用von Kossa染色检查晶体沉积。将乙醛酸与预注射沟肠杆菌的大鼠的晶体沉积到肾盂中明显比仅注射乙醛酸或泄殖沟肠杆菌的大鼠严重（图7b）。

图 7

泄殖腔肠杆菌对SD大鼠肾脏病理生理学变化的影响。a 代表性显微照片显示来自指定大鼠的不同组的TUNEL染色图像，以评估细胞凋亡。*P<与对照组相比，以SE±平均值表示。b Von Kossa染色检测大鼠肾脏中的晶体沉积，与其他组相比，乙醛酸和泄殖肠杆菌加剧了晶体沉积。数据表示为与对照组相比，SE.*P<0.05的平均±。c蛋白质印迹测定显示，与对照组相比，乙醛酸组或泄殖肠杆菌组肾组织中BMP2、OPN、IL-6、MCP-1的表达水平升高。乙醛酸和泄殖腔肠杆菌一起可以明显增强这些作用。使用ImageJ软件对蛋白质印迹带进行定量。*P <与对照组相比，以SE±平均值表示。

泄殖肠杆菌对BMP2、OPN、IL-6和MCP-1表达的影响

          蛋白质印迹分析表明，与对照大鼠相比，注射乙醛酸或肠杆菌泄殖腔的大鼠炎症相关蛋白IL-6，MCP-1和成骨细胞相关蛋白BMP2和骨桥蛋白（OPN）的表达显着增加，并且当这些大鼠同时用肠杆菌泄殖腔和乙醛酸处理时，这些增加显着增强（图7c）。

讨论

        肾结石的成分可分为以下几种类型：草酸钙，磷酸钙，鸟粪石，嘌呤或胱氨酸。长期以来，感染一直被认为仅与鸟粪石有关，这些结石中存在的大多数细菌，如变形杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属和棒状杆菌属，通过脲酶促进鸟粪石结石的形成[10]。然而，鸟粪石结石仅占所有尿结石的4%[23]。细菌已被证明与肾结石的相关性更广泛，肾结石患者无论结石成分如何，通常伴有尿路感染[24]。大多数尿结石是草酸钙与磷灰石联合使用。以前对CaOx结石的研究曾经专注于代谢和遗传因素。然而，肾结石通常是单侧的，无法用这些系统因素来解释。可能存在一些导致结石形成的局部因素。更重要的是，在钙基结石中发现了一些脲酶阴性生物，例如大肠杆菌。因此，细菌可能与CaOx结石有关[14]。尽管许多研究揭示了这种关联，但细菌在CaOx结石形成中的作用仍然知之甚少。

        许多研究已经探索了钙基尿结石的微生物组。Barr-Beare E和他的同事发现了CaOx结石的显性细菌群落，包括肠杆菌科和假单胞菌属[25]。Ryan等人添加到这些细菌群落中，额外鉴定了葡萄球菌，Veillonella，链球菌，棒状杆菌，嗜血杆菌，乳酸杆菌和双歧杆菌[14]。然而，在以前的研究中仍然存在许多局限性。大多数研究收集结石或膀胱尿液，尽管患者只有单侧结石，结石或膀胱尿液的微生物群是两侧上尿路的混合物，不能代表结石侧和非结石侧肾脏之间的差异。为了补充间隙，我们收集了单侧CaOx结石患者两侧和非结石侧的骨盆尿液，以进行自我控制。因此，我们可以减少系统因素的影响，并探索与CaOx结石相关的局部因素。此外，未追踪患者在4周前的抗生素暴露情况，以防抗生素破坏最初定植的细菌[26]。对从患者肾脏两侧采集的盆腔尿液进行下一代16S rRNA基因测序，结果可准确到物种水平;因此，我们可以清楚地认识到结石侧和非结石侧肾脏之间的区别。

通过对尿液样本进行16S rRNA基因测序，发现双侧肾盂尿液中26种细菌存在显著差异，这些细菌富集于PWY-6478、PWY-6572、PWY-7374、PWY-6944（MetaCyc数据库），肾盂尿液中富含结石侧的细菌多富集于PWY-6944途径（雄烯二酮降解）。雄烯二酮是一种雄激素，尿雄激素与尿钙和柠檬酸盐排泄显著相关，最终导致结石形成[7]。更重要的是，在双侧肾盂尿液中26种差异表达的细菌中，泄沟肠杆菌和红杆菌属在结石侧的肾盂尿液中含量最高。金缕梅属是一种磷酸盐增溶菌（PBS），它经常从土壤中分离出来[27]。目前，对它的研究主要集中在农业上。更重要的是，Ryan A. Dornbier和他的同事们发现，从CaOx结石中分离出的粪肠杆菌在16S rRNA基因测序上具有一致的富集。因此，我们不太关注白蜀杆菌。与此同时，对泄殖腔肠杆菌的探索每年都在增加。泄殖肠杆菌是与肠道的重要共生菌，属于肠杆菌属、肠杆菌科、肠杆菌目。它通常存在于人体40-80%的肠道中，也可以存在于呼吸道和尿道中，引起尿路和呼吸道感染[28]。泄殖肠杆菌具有很强的粘附力和较弱的侵袭性，可以通过将细胞骨架蛋白重新排列成宿主细胞来发挥作用[28，29]，其主要参与病理过程的调节，例如宿主细胞的炎症反应，氧化应激和脂质代谢[30]。此外，研究发现，泄殖腔肠杆菌可以激活炎症和自噬途径，引发体内代谢紊乱，导致异位钙化，即动脉粥样硬化斑块的形成[31]。这些表明，兰德尔钙斑块作为肾脏异位钙化的形成也可能受到泄殖肠杆菌的调节。据我们所知，我们是第一个发现CaOx结石患者肾盂尿液中存在的泄殖腔肠杆菌。泄殖腔肠杆菌诱发CaOx结石的机制尚不清楚。

    为了进一步研究泄殖腔肠杆菌在CaOx结石形成中的作用，我们进行了泄殖腔肠杆菌的全基因组测序。细菌通过其毒力因子或其代谢物，细胞外囊泡作用于受体细胞。毒力因子是细菌毒力的组成部分，它们以两种形式起作用：侵袭性和毒素。通过比较泄殖肠杆菌的基因编码蛋白序列与VFDB（致病菌毒力因子）数据库中的氨基酸序列，发现鞭毛、脂多糖、气霉素和脲酶具有较高的同源性，其中鞭毛相关蛋白丰度最高。鞭毛蛋白是细菌运动、动力元件和毒力因子的重要支架。鞭毛蛋白是Toll样受体5（宿主膜蛋白受体）的唯一特异性配体，具有很强的免疫原性。作为细菌独特的结构蛋白，鞭毛蛋白也是细菌中最丰富的蛋白质之一。作为毒力因子，鞭毛蛋白可促进致病菌的侵袭。因此，鞭毛蛋白是宿主免疫监测的关键靶标。当致病菌侵入宿主时，天然免疫受体TLR5可以很容易地识别鞭毛蛋白，从而诱导MAPK-和NF⁃κB介导的炎症反应[32]。一些研究人员报告说，鞭毛蛋白可以通过促进其结晶，生长和聚集来加速CaOx沉积物[12]。更重要的是，鞭毛蛋白还可以促进Ca2+通过钙细胞膜通道流入[33]。然而，鞭毛蛋白与CaOx沉积物的关联只是表面上的研究，应该应用更多的研究来探索鞭毛素诱导CaOx沉积物的机制。

     KEGG和GO分析显示，泄殖腔肠杆菌可能在离子结合和信号转导中起重要作用。Cherng等人发现，细菌感染有助于在注射细菌后通过钙相关离子通道形成CaOx沉积物[34]。细胞信号转导是细胞通过细胞膜或细胞内受体经历信息分子的刺激，然后通过细胞内信号转导系统转化，从而影响细胞的生物学功能的过程。它广泛存在于许多生物过程中。有许多信号转导途径参与CaOx结石的形成。P-38 / JNK MAPK转导途径在CaOx结石形成过程中打开[35]。

为了验证我们之前的说法，我们进行了体内实验。我们评估了不同处理的大鼠之间的细胞凋亡状况和肾脏晶体沉积。预先注射阴肠杆菌可明显加速乙醛酸诱导的大鼠代谢紊乱的凋亡和晶体沉积。与对照组相比，单独注射乙醛酸或泄殖肠杆菌在细胞凋亡状况和晶体沉积方面没有任何差异。更重要的是，IL-6，MCP-1，BMP2和OPN在注射乙醛酸或氯酸肠杆菌的大鼠中的表达高于对照组。用泄殖腔肠杆菌和乙醛酸处理可以增强这些蛋白质的增加。先前已经证明IL-6和MCP-1表明炎症与肾结石之间存在密切关系，而我们之前的研究已经证实，成骨转化相关蛋白BMP2和OPN在结石形成中起重要作用[36，37]。因此，我们可以推测，泄殖肠杆菌的预先存在将通过炎症过程和成骨转化来增强CaOx结石形成中代谢紊乱的作用。然而，CaOx结石的形成过程很复杂，细菌本身可能引起感染，从而诱导炎症反应和巨噬细胞募集[38]。我们不能确定泄殖肠杆菌是通过炎症和成骨转化形成CaOx结石的特殊调节剂，或者这是否是肾脏感染的一般现象。但我们的研究只是基于单侧CaOx结石患者骨盆尿液中存在不同微生物群的初步探索，我们的体内实验表明，泄殖肠杆菌与CaOx结石的形成有关，而具体机制仍有待进一步探索。此外，我们期待未来的研究能够探索其他细菌与结石形成的关系。

          总之，我们的研究结果表明，细菌的发生与CaOx结石的形成有很大相关性。泄殖腔肠杆菌及其鞭毛蛋白被认为通过离子结合和信号转导对CaOx结石的形成产生影响。我们进行的体内实验已经确定，泄殖腔肠杆菌可以加速代谢紊乱大鼠结石的形成。然而，我们只是假设了CaOx结石形成的可能过程;需要进一步的研究来探索泄殖腔肠杆菌的详细机制及其鞭毛蛋白诱导CaOx结石的形成。更重要的是，在我们的研究中应该招募更多的患者，以提高我们结果的可信度。

结论

      定植于肾脏的微生物组与肾结石的形成有关。在肾脏中定植的泄殖肠杆菌可以加速CaOx结石的形成，而具体的机制仍需要更多的探索。