科研 | 郑大一附院（IF：6.050）：颈动脉粥样硬化患者肠道微生物群的变化(国人佳作)

编译：微科盟居居，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

颈动脉粥样硬化(Carotid atherosclerosis，CAS)反映了全身动脉粥样硬化和心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)的主要病理过程，即颈动脉内膜中层增厚、颈动脉斑块形成和颈动脉狭窄。越来越多的证据表明，肠道微生物群在心血管疾病和肠脑疾病中发挥重要作用，但肠道微生物群组成和代谢产物与CAS的相关性尚未得到全面的研究。我们使用全基因组鸟枪法测序对31例CAS患者和51例健康对照的肠道微生物组进行了全基因组关联分析。我们发现了几个风险因素(腰围、身体质量指数、舒张压、收缩压、空腹血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇)和炎症标志物(白细胞计数和中性粒细胞绝对值)均显著高于健康对照组。CAS组富集21种微生物物种和142条代谢通路，健康对照组富集10种微生物物种和1条代谢通路。其中，Bacteroides eggerthii、Escherichia coli和Klebsiella pneumoniae在CAS组中最丰富的物种，而Parabacteroides unclassified、Prevotella copri、Bacteroides sp 3_1_19和Haemophilus parainfluenzae在对照组中最丰富。最后，我们发现，CAS组富集的大多数肠道微生物和微生物通路与临床特征显著正相关，而健康对照组富集的微生物和微生物通路与除高密度脂蛋白胆固醇外的临床特征显著负相关。此外，还鉴定了肠道微生物与一些微生物通路(短链脂肪酸、脂多糖和甲基萘醌生物合成)之间的关联。本研究结果表明，存在一种循环途径，可以提高氧化三甲胺在CAS患者中的循环浓度，但降低其在健康对照组中的浓度。

论文ID

原名：Gut Microbiome Alterations in Patients With Carotid Atherosclerosis 

译名：颈动脉粥样硬化患者肠道微生物群的变化

期刊：Frontiers in Cardiovascular Medicine

IF：6.050

发表时间：2021年11月19日

通讯作者：丁素英＆李昂

通讯作者单位：郑州大学第一附属医院体检中心，河南省基因医院

DOI号：10.3389/fcvm.2021.739093

实验设计

前言

心血管疾病(CVD)已经成为全球残疾和过早死亡的主要原因。根据2017年欧洲心血管疾病统计，CVD在欧洲导致390万人死亡，在欧盟导致180多万人死亡，其已成为欧洲75岁以下人群死亡的主要原因。我国大约有2.9亿人患有心血管疾病，主要是高血压、中风和冠心病。因此，心血管疾病已经成为一项严重的全球公共卫生问题。动脉粥样硬化被认为是大多数心血管病的主要病理表现，颈动脉粥样硬化(CAS)是最常见和最重要的动脉粥样硬化类型。颈动脉粥样硬化所引起的颈动脉狭窄或闭塞性疾病，根据颈动脉粥样硬化的进展分为颈动脉内膜中层增厚、颈动脉斑块形成和颈动脉狭窄。许多研究表明，高龄、男性、吸烟、糖尿病、高血压、血脂异常与CAS发病风险增加有关。

越来越多的证据表明，肠道微生物群在动脉粥样硬化的发生发展中发挥着重要作用，已成为预防和治疗动脉粥样硬化的新靶点。既往研究表明，肠道微生物群可能通过增加肥胖和糖尿病的风险间接影响动脉粥样硬化，或通过产生氧化三甲胺(TMAO)直接增加动脉粥样硬化病变的风险因素。关于TMAO，多项动物实验表明，肠道微生物群可通过代谢膳食卵磷脂产生三甲胺(TMA)，然后TMA被肝脏含黄素单加氧酶(FMO)代谢产生一种新的动脉粥样硬化的风险因子(即TMAO)，其可诱发心血管疾病和肠脑紊乱，如阿尔茨海默病。TMAO可上调巨噬细胞清道夫受体的表达，增加热休克蛋白和促炎细胞因子的表达，提高血浆胆固醇水平，促进动脉粥样硬化性CVD的发生发展。

此外，有证据表明抑制TMAO的产生可以降低动脉粥样硬化的发病风险。TMAO的产生可以通过使用益生菌或抗生素、抑制肠道菌群代谢通路或减少胆碱和磷脂酰胆碱的膳食摄入量来调节。已知有两种机制可以降低TMAO水平。第一种机制，一些细菌(如古细菌)可以在在肠道中将TMA转化为甲烷，并减少肝脏中TMA产生的TMAO；第二种机制，一些抗病毒药物可以改变肝脏含黄素单加氧酶3(FMO3)的活性，进而阻断或减少TMAO的产生。现有的关于肠道微生物群与动脉粥样硬化关系的证据主要来源于冠状动脉粥样硬化疾病和动物实验。然而，缺乏对这一主要CAS群体的宏基因组特征的队列研究，阻碍了对微生物组作用的进一步研究。虽然冠状动脉粥样硬化和CAS主要是动脉粥样硬化的反映，具有一些相同的风险因素，但它们具有不同的表型和疾病表现，如冠心病的冠状动脉粥样硬化和脑梗死的CAS。本研究通过横断面队列研究肠道微生物群与CAS的关系，为进一步预防和降低我国CAS的发病风险提供理论依据。

结果

1 受试者的临床特征

该研究包括31名CAS患者和51名健康参与者的横断面队列(图1A)。风险因素方面，CAS组WC、BMI、DBP、SBP、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C和SUA均显著高于对照组，HDL-C组则相反。同样，炎症标志物方面，CAS组的WBC和NEUT显著高于健康对照组(图1B,C;表1)。此外，两组在吸烟、饮酒等生活习惯方面没有显著差异。

图1 研究设计及临床参数特征。(A)研究设计包括横断面队列。(B) CAS组与健康对照组的风险因素比较。(C) CAS与健康对照组炎症标志物的比较。*,**和***分别表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001，与健康对照组相比。CAS，颈动脉粥样硬化；WC，腰围；BMI，身体质量指数；DBP，舒张压；SBP，收缩压；FBG，空腹血糖；HbA1c，糖化血红蛋白；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；SUA，血清尿酸；RBC，红细胞；WBC，白细胞；PLT，血小板；NEUT，中性粒细胞绝对值；Lymph，淋巴细胞绝对值；NLR，中性粒细胞-淋巴细胞比值。

表1 CAS患者和健康对照组的主要人口学特征和血清特征。

缩写：CAS，颈动脉粥样硬化；WC，腰围；BMI，身体质量指数；DBP，舒张压；SBP，收缩压；FBG，空腹血糖；HbA1c，糖化血红蛋白；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；SUA，血清尿酸；RBC，红细胞；WBC，白细胞；PLT，血小板；NEUT，中性粒细胞绝对值；Lymph，淋巴细胞绝对值；NLR，中性粒细胞-淋巴细胞比值。

2 CAS和健康对照组的群落多样性

如图2A所示，CAS组和对照组的肠道微生物群以4个丰富的门为主，组间差异不显著。然而，组间在目水平上肠杆菌目(Enterobacteriales)和巴斯德氏菌目(Pasteurellales)的丰度；科水平上肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的丰度；以及属水平上氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、埃希菌属(Escherichia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和普雷沃氏菌属(Prevotella)的丰度差异显著。CAS组Prevotellaceae、Pasteurellaceae、Haemophilus和Prevotella的丰度显著高于对照组(补充表1)。此外，根据Shannon和Gini指数，显示CAS组患者微生物群落在种水平上的α多样性与健康对照组相比无显著差异(Wilcoxon秩和检验, p=0.58和p=0.67;图2B)。同样，在由Bray和Pearson距离(Wilcoxon秩和检验, p=0.65和p=0.28)确定的β多样性方面，显示CAS组患者的微生物群与健康受试者没有差异(图2C)。

图2 微生物群落的比较。(A)颈动脉粥样硬化组与健康对照组的肠道微生物群具有丰富的门、目、科、属。(B) CAS组与对照组的α多样性比较(Shannon和Gini指数)。(C) CAS组和对照组之间β多样性(由Bray和Pearson距离确定)的比较。

3 肠道微生物组成及与临床特征的相关性分析 3.1 微生物群组成分析

比较了CAS组和对照组在种水平上的差异微生物，鉴定出45种不同的物种(Wilcoxon s秩和检验，P＜0.05;补充表2)，剔除低出现频率和低丰度的物种后，共鉴定出31种丰度差异显著的物种(P＜0.05;图3A)，即CAS组有21个富集物种，对照组有10个富集物种(图3A)。在种水平分析中，有10种属于厚壁菌门(Firmicutes)的物种(如Abiotrophia defectiva、肠氨基酸球菌Acidaminococcus intestini、溶血孪生球菌Gemella haemolysans、粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae、乳酸明串珠菌Leuconostoc lactis、埃氏巨球形菌Megasphaera elsdenii、Ruminococcus sp JC304、咽峡炎链球菌Streptococcus anginosus、Turicibacter sanguinis和Turicibacter unclassified)和4种属于变形菌门(Proteobacteria)的物种(大肠杆菌Escherichia coli、Halomonas unclassified、肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae和Pantoea unclassified)在CAS组中富集，3种属于拟杆菌门(Bacteroidetes)的物种(Bacteroides sp 3_1_19、P. unclassified和Prevotella copri)在健康对照组中富集。

图3 两组间的微生物组差异及与临床特征的相关性。(A)颈动脉粥样硬化(CAS)组与健康对照组的物种丰度差异。(B)物种与临床参数的相关矩阵。粉色表示正相关，而蓝色表示负相关。*,**和***分别表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001。(C) 7个风险因素和7个最频繁相关物种的显著相关数。

3.2 肠道微生物群与临床特征的关联

在本研究中，我们将临床特征分为风险因素和炎症标志物，并使用Spearman相关分析来探讨其与物种丰度的相关性。我们发现，除HDL-C外，CAS组中富集的大多数肠道微生物与临床特征显著正相关，而健康对照组中富集的肠道微生物与临床特征显著负相关。更重要的是，物种与风险因素的负相关比与炎症标志物的负相关的频率更高(图3B,补充表3)。此外，在11个风险因素中，BMI与细菌物种的相关性最大(n=9，p<0.05)，其次是HDLC (n=8，p<0.05)、TG(n=7，p<0.05)、HbA1c (n=6，p<0.05)、TC (n=5，p<0.05)、LDL-C (n=4，p<0.05)和FBG (n=4，p<0.05)。在这31个物种中，M. elsdenii与临床特征的相关性最强，其次是B. sp 3_1_19 (n=6，p<0.05)、Bacteroides coprophilus (n=5，p<0.05)、G. haemolysans (n=4，p<0.05)、A. defectiva (n=4，p<0.05)、P. unclassified (n=4，p<0.05)和Actinomyces massiliensis (n=4，p<0.05;图3C)，而只有A. massiliensis在健康对照组中富集。

4 与CAS和对照组微生物群相关的功变化 

4.1 不同主体的微生物群特性的功能变化

我们进一步使用HUMAnN2的MetaCyc通路数据库构建了每个样本的494条通路的功能概况。我们比较了通路丰度的差异，确定了145种差异通路(Wilcoxon秩和检验;P＜0.05)。剔除低出现频率和低丰度的通路后，还保留了143条丰度差异显著的通路(补充表4,图4)。CAS组共富集142条通路，而对照组仅富集1条通路。健康对照组中富集的通路是甲醛同化III(P185-PWY，代谢为3-磷酸甘油酸)，其中甲醛是TMA生成TMAO(PWY-6968，三甲胺降解)的中央代谢产物。

CAS组富集的142条通路中，36条负责辅助因子、载体和维生素的生物合成；23个与能量产生[三羧酸循环(TCA)]和碳水化合物的降解、利用和同化(次级代谢物、丙酸、D葡糖二酸和糖类)有关；其中15条参与L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸和L-天冬酰胺的生物合成；12个参与碳水化合物、脂肪酸和脂类生物合成；11个参与甲基萘醌和泛醇的生物合成；5个和4个分别参与发酵为短链脂肪酸(SCFAs)和脂多糖(LPS)生物合成(dTDP-糖、GDP-糖、脂肪酸和脂质生物合成)。此外，与健康对照组相比，CAS患者在PWY-6318(L-苯丙氨酸降解)、PWY-5431(芳香化合物降解)、PWY-5415(儿茶酚降解)、PWY-5417(儿茶酚降解)和protocatechuateortho-cleavage-PWY(原儿茶酸降解)通路上存在明显差异，这些通路的代谢物都参与了TCA循环。

图4 健康对照组和颈动脉粥样硬化(CAS)组MetaCyc通路丰度差异(p＜0.05, Wilcoxon秩和检验)。

4.2 与一组临床特征相关的微生物通路

我们结合不同MetaCyc通路的结果和临床特征进行Spearman相关分析(p＜0.05)。使用Spearman相关系数构建热图(图5,补充表5)。显然，几乎所有通路都与临床特征呈正相关，而只有少数通路与炎症标志物如RBC、PLT和淋巴细胞绝对值呈负相关。重要的是，TC、LDL-C和FBG与大多数CAS组富集的通路呈显著正相关，TG、HbA1c、NLR和BMI也与CAS组富集的通路呈正相关。相反，在健康对照组中富集的P185-PWY与大多数临床特征呈负相关。令人惊讶的是，只有TC和LDL-C与甲基萘醌、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺生物合成显著正相关。综上所述，与CAS相关的通路可能有助于脂类和碳水化合物的生物合成和降解。

图5 颈动脉粥样硬化相关通路的Spearman相关矩阵及其临床特征。单格颜色表示相关类型(粉色:正相关，蓝色:负相关)。*,**和***分别表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001。

4.3 与一组微生物物种相关的微生物通路

我们选择了4类微生物通路，即甲醛同化(在健康对照组中富集)、发酵为SCFA、LPS生物合成和甲基萘醌生物合成(在CAS患者中富集)通路，并使用Spearman相关分析分析了微生物通路与物种之间的相关性(p＜0.05)。使用Spearman相关系数构建热图(图6,补充表6)。有趣的是，大肠杆菌(E. coli)、H. unclassified、K. pneumoniae和P. unclassified(在CAS组中富集)对负责SCFA、LPS和甲基萘醌生物合成的通路有明显更强的贡献。其中，E. coli与CAS组中从混合酸发酵(r=0.521)到甲基萘醌生物合成(r=0.925)的所有富集通路的相关性最大。此外，健康对照中富集的微生物物种与CAS组富集的通路呈负相关，与P185-PWY呈正相关。最后，在健康对照组中富集的Candidatus Zinderia insecticola与P185-PWY显著正相关(r=0.470)，而在CAS组中富集的H. unclassified与P185-PWY显著负相关(r =-0.307)。

图6 微生物通路和物种的Spearman相关矩阵。单格颜色表示相关类型(粉色:正相关，蓝色:负相关)。*,**和***分别表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001。

讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，会在不知情的情况下导致一些严重的并发症，如血栓、心脏病发作、中风或心力衰竭；因此，早期预防和治疗至关重要。众所周知，动脉粥样硬化性疾病与多种风险因素有关，如肥胖、2型糖尿病、高脂血症、高血压和全身慢性炎症。在本研究的结果中，与健康对照组相比，CAS组在风险因素(WC、BMI、DBP、SBP、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C和SUA)和炎症标志物(WBC和NEUT)方面表现出显著差异。目前，CVD和CAS的治疗方式主要包括药物、手术和风险因素的控制。然而，长期药物治疗是不可行的，而且可能与严重的不良反应有关，而且老年患者严格饮食和锻炼的依从性很低。有趣的是，越来越多的证据表明，人类肠道微生物群可能影响动脉粥样硬化的发展和进展，从而为探索CAS的治疗提供了新的视角。因此，我们分析了中国CAS患者肠道微生物的特征及其与微生物代谢通路的相关性。

本研究发现，两组均以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)为主，且在前期研究中，CAS组的拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度高于对照组。此外，两组有31种物种的丰度差异显著，其中CAS组21种，对照组10种。在31个物种中，有7个物种的丰度高于其他物种，即CAS组的Bacteroides eggerthii、E. coli和K. pneumoniae，对照组的P. unclassified、P. copri、B. sp 3_1_19和Haemophilus parainfluenzae。此外，我们发现风险因素和炎症标志物与CAS组中大多数富集物种呈正相关，而与健康受试者中的富集物种呈负相关。之前关于冠状动脉粥样硬化的研究也得到了类似的结果，即CAS组中富集瘤胃球菌(Ruminococcus)、大肠杆菌(E. coli)和链球菌(Streptococcus)，对照组中富集P. copri、拟杆菌属(Bacteroides)和副拟杆菌属(Parabacteroides)。此外，已有研究表明，CAS组瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和对照组普雷沃氏菌(Prevotella)与TMAO的产生水平密切相关。

在之前的研究中，TMAO通过抑制肌肉蛋白中肌动球蛋白运动活性来维持水分胁迫生物和组织中的细胞体积，并增强蛋白质的稳定性(并有利于蛋白质折叠)。近年来，许多研究表明，TMAO在心血管疾病、肾脏疾病、2型糖尿病和癌症患者中的循环浓度升高，可促进动脉粥样硬化的发展。TMAO可以从几个来源获得。首先，膳食来源，即胆碱、磷脂酰胆碱、L-肉碱和其他含甲胺营养素为微生物介导TMA的产生提供底物，TMA进入门静脉循环，随后由肝脏含黄素单加氧酶家族的酶转化为TMAO。在我们的研究中，一些物种(E. coli和Halomonas)、甲基萘醌生物合成代谢通路(PWY-5838、PWY-5840、PWY-5845和PWY-5899)和TMAO电子转移(PWY0-1347和PWY0-1578)在CAS组中富集。此外，这些通路与大肠杆菌和盐单胞菌(Halomonas)的丰度呈显著正相关。大肠杆菌携带H吸收氢化酶(氢化酶1和氢化酶2)和两种TMAO还原酶(torA编码的诱导酶和tor Z编码的第二个TMAO还原酶)。大肠杆菌和盐单胞菌参与了甲基萘醌的生物合成，有利于TMAO的还原。因此，TMAO可能始终参与CAS患者的合成和还原循环过程，提高了TMAO的循环浓度，增加CAS的发病风险。

在健康对照组中，发现了P185-PWY通路(甲醛同化III)。该通路的关键步骤是在微生物毕氏酵母(Pichia)和念珠菌(Candida)的作用下，将乙醇醛基团从D-木酮糖-5-磷酸转移到甲醛，形成二羟基丙酮和D-甘油醛-3-磷酸。此外，在TMAO产生途径(PWY-6968通路)中，三甲胺氧化物醛缩酶催化TMAO非氧化、非水解裂解为二甲胺和甲醛。因此，甲醛可能是降低TMAO循环浓度的重要分子。在之前的研究中，将TMA转化为甲烷和改变FMO3活性被认为是降低TMAO水平最有效的策略。

此外，本研究的结果表明，一些在CAS组富集的革兰氏阴性菌，如E. coli和K. pneumoniae，与LPS生物合成通路有很强的正相关关系，导致血浆LPS水平升高。LPS可促进接头蛋白的募集，诱导轻度炎症状态，加重动脉粥样硬化的进展。因此，在我们的结果中，大多数LPS生物合成通路与WBC、PLT、NEUT和NLR呈正相关。而在健康对照组中富集的H. parainfluenzae和P. copri与LPS生物合成通路呈负相关，从而降低了LPS水平，降低了CAS的发病风险。

结论

本研究中，我们确定了肠道微生物群和CAS之间的宏基因组关联。与健康对照组相比，一些风险因素和炎症标志物与CAS患者中富集的微生物物种和通路具有很强的正相关性，表明肠道微生物群与CAS之间存在内在联系。此外，与TMAO水平和LPS生物合成密切相关的特定微生物物种和通路可能是代谢紊乱新疗法的治疗靶点。在未来的研究中，考虑到CAS的稳定性，我们将对颈动脉斑块进行分组，以确定具体的微生物物种和通路。此外，我们将进行动物实验来验证这些结果。

打赏