从NCCL室间质评看国内免疫治疗TMB检测难点及现状

转自：测序中国

导读 

2022年2月，国家卫生健康委临检中心（NCCL）公布了2021年“肿瘤突变负荷检测生物信息学分析流程室间质量评价预研活动结果报告”。全国共30家实验室参与本次评价。结果表明，  所有实验室提交结果的总合格率仅有43.6%，其中配对样本和非配对样本合格率分别为50%和14.3%，显著低于既往驱动突变质评的合格率。  既往驱动突变质评通常是单点或者少数几个位点的检测，对于全景检测的准确性要求较低；此次TMB质评是对整体检测panel的全景评估，对于所有位点的准确性均提出了较高要求，技术难度远大于驱动突变的检测，可能成为国内NGS检测公司质量评估的重要标尺。  

图1. 肿瘤突变负荷NCCL室间质评报告

TMB前世今生

肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden，TMB）的定义是每百万碱基中被检测出的，体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，是反映肿瘤细胞携带的突变总数的生物标志物。肿瘤组织中突变的基因越多，就越有可能产生更多的异常的蛋白质，进而越有可能被免疫系统识别，从而激活人体的免疫应答反应，起到抗肿瘤效应。因此TMB越大，患者肿瘤免疫治疗的疗效可能越好。TMB在晚期肿瘤的免疫治疗药物选择上具有重要指导意义。2020年6月，FDA批准帕博利珠单抗单药治疗组织TMB-H（组织TMB≥10个突变/Mb），既往治疗后疾病进展且无满意替代疗法的不可手术或转移性成人和儿童实体瘤患者。这标志着TMB正式出道，成为免疫治疗伴随诊断生物标志物。目前市场上有大量公司推出TMB检测产品，不同公司的检测panel、计算方法等差异显著，如何评估不同TMB检测产品的好坏是目前临床面临的重要困境。

从NCCL质评看

如何评估TMB检测产品好坏

TMB的复杂本质决定了检测的困难。如前文所述，TMB是反映了体细胞突变个数的指标参数，它是一个连续可变的生物标志物，而不是一个离散的生物标志物（如基因突变位点）。本次NCCL室间质评将TMB检测的评估分为两个环节进行评估，具体评判方案如下：

第一个环节是评估体细胞突变的准确性。体细胞突变检测准确性依据检测的精确率（Precision）和召回率（Recall）的调和平均数（F1）来评估。精确率为真阳性（TP）突变占所有检测为阳性（TP+FP）的体细胞突变的概率。召回率为真阳性（TP）突变占所有实际阳性（TP+FN）的体细胞突变的概率。

第二环节是评估TMB计算方法的准确性。根据检测到的体细胞突变，实验室依据各自过滤条件计算不同检测样本的TMB值。实验室检测的所有样本落入标准TMB值±30%区间内的数量除以总样本数以评估TMB值计算的准确性。100%检测准确为满分100分，依此类推。

最终成绩（PT）计算依据上述两项指标进行。体细胞突变准确性F1≥0.8则以TMB值准确性为最终得分。体细胞突变准确性F1＜0.8则最终PT分为0分。PT值满分100分，大于或等于80分为合格，小于80为不合格。

图2. NCCL肿瘤突变负荷室间质评标准与逻辑

从NCCL质评看

国内TMB计算方法差异

本次NCCL质评统计了不同TMB检测产品的计算方法差异，包括是否包括missense类型突变、是否包括nonsense类型突变、是否包括silent类型突变、是否包括indel类型突变，纳入评估indel长度范围、是否过滤热点突变、是否过滤驱动突变等。不同检测产品TMB计算方法差异显著，在上述指标中均存在一定的差异。质评进一步评估了不同过滤条件与最终PT成绩的相关性，结果显示不同过滤条件下PT成绩没有显著差异（图3），表明目前影响国内TMB检测产品最关键的环节仍然是突变检测的准确性。

图3. 不同过滤参数下的实验室合格率

 从NCCL质评看

国内TMB检测准确性现状

本次室间质评反馈的39份结果中：10份（25.6%）结果因体细胞突变检测准确性不合格（F1＜0.8）直接判定为不合格，8份（20.5%）结果因TMB值计算准确性低最终判定为不合格。只有17份（43.6%）最终通过室间质评判定合格。进一步的分析提示，造成本次室间质评通过率低的主要原因在于体细胞突变检测准确性较低，存在漏检（假阴性）和错检（假阳性）的情况。在所有漏检的突变中，74.2%（573/772）均为低频突变（VAF≤10%）。而在所有错检体细胞突变中51.1%（705/1379）为低频突变（VAF在1-5%）。对比本次TMB质评的合格率和前期大量驱动突变质评的合格率，我们不难发现国内TMB检测仍然存在良莠不齐的情况。驱动突变检测只需要关注少数重点区域，各家产品对这些重点区域的关注度较高，检测准确性有所保证；而TMB检测需要对检测panel内所有位点的突变进行评估，对于检测panel所有位点的检测准确性均提出了较高的要求，是衡量国内NGS公司检测质量的重要标尺。  

图4. CMDE官网TMB试剂盒查询结果

基于此次NCCL室间质评的结果，我们不难发现国内TMB检测行业仍缺乏统一标准，不同检测产品仍然良莠不齐。目前国内大部分TMB检测产品仍然采用第三方检验实验室的方式开展，通过CMDE官网信息查询到的唯一进入试剂盒申报阶段的世和基因TMB检测试剂盒（图4）也参加了此次质评，并最终获得满分。希望监管机构和检测公司能积极推动TMB检测的规范化和标准化，让TMB检测更为精准，惠及中国广大肿瘤患者。