研究β-葡萄糖苷酶抑制剂在草菇采后贮藏中的应用前景

派森诺与上海市农业科学院携手合作，于近期在《Postharvest Biology and Technology》上发表了β-葡萄糖苷酶抑制剂在草菇采后管理中应用的研究成果。

草菇(Volvariella volvacea)又称兰花菇，味道鲜美，营养丰富，脂质含量低。低温贮藏是大多数食用菌保存和运输的常规方法。然而，在传统的保存温度(4℃)下，草菇会变软、液化，甚至腐烂，这种现象被称为“低温自溶”。草菇的低温自溶限制了这种商业栽培蘑菇的采后贮藏和销售。已有研究表明，UBEV2特异性泛素结合酶E2 (UBEV2)（L345-0044）是一种有效防止低温自溶的抑制剂。然而L345-0044作为食品防腐剂的安全性是有争议的。因此，寻找一种更为安全的保存草菇的食品添加剂是十分必要的。

本研究采用绝对定量转录组和代谢组学方法，分析在4℃条件下L345-0044处理后草菇子实体的基因和代谢产物变化，并揭示UBEV2介导的酶通路。本文提供了一种更为安全的方法来管理草菇的采后贮藏，并有望应用于商业栽培模式。

研究路线

研究结果

1.草菇子实体的UMI绝对定量转录组

对草菇样本进行UMI绝对定量转录组分析。结果显示，0H_vs_24H中有5255个差异表达基因(DEGs)，0H_vs_L24H中有5313个差异表达基因，24H_vs_L24H中有1218个差异表达基因(图2A)。主成分分析显示，0H、24H和L24H组内具有很好的重复性并且组间可以明显的分开(图1B)。Venn分析显示，0H_vs_24H、0H_vs_L24H、24H_vs_L24H比较组间共有889个差异重叠基因(图1C)。

DEGs的Heatmap分析显示，L345-0044处理显著影响了24H和L24H组的基因表达 (图1D)。KEGG通路富集分析表明，0H_vs_24H中上调的DEGs富集在过氧化物酶体、吲哚生物碱生物合成和丙酸代谢通路。0H_vs_24H中下调的DEGs在核糖体、蛋白酶体和嘌呤代谢通路富集。0H_vs_L24H中上调的DEGs在内质网的过氧化物酶体和蛋白质加工以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解通路富集。0H_vs_L24H中下调的DEGs在核糖体、蛋白酶体、淀粉和蔗糖代谢通路富集。24H_vs_L24H中DEGs在内质网蛋白加工通路显著富集(图1E)。24H_vs_L24H中上调的DEGs在内质网蛋白加工、蛋白分泌和N-聚糖生物合成通路富集。24H_vs_L24H中表达下调的DEGs在淀粉和蔗糖代谢、酵母减数分裂以及果糖和甘露糖代谢通路富集。以上结果表明，L345-0044处理影响了内质网蛋白加工通路。

图1草菇子实体的绝对定量转录组分析

2.草菇子实体的非靶向代谢组学

采用LC-MS/MS方法检测18个草菇子实体(0H、24H和L24H每组各6个)的代谢物。基峰色谱图(BPC)表明，在正负离子模式下，3组样本差异明显(图2A和B)，说明L345-0044处理影响了草菇在CS胁迫下的代谢过程。根据p值≤0.05，VIP≥1的标准筛选差异代谢物，在正离子模式下0H_vs_24H中有3106个代谢物上调，2134个代谢物下调。在0H_vs_L24H中有586个代谢物上调，1949个代谢物下调(图2C)。负离子模型也有类似的结果(图2D)。QC分析表明仪器稳定性良好，数据可靠。OPLS-DA分析显示组间可以明显分开，进一步证实L345-0044在CS处理下影响了草菇的代谢过程(图2E)。

利用MetPA数据库对0H_vs_24H中上调的代谢物进行通路富集分析，筛选出5条显著富集通路(Impact >1)，包括亚油酸代谢和精氨酸生物合成。通过对0H_vs_24H中下调的差异代谢物进行通路分析，筛选出7条显著富集通路，如酮体的合成降解、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成、果糖和甘露糖代谢。通过对0H_vs_L24H中下调的差异代谢物进行通路分析，筛选出4条显著富集通路，如酮体的合成和降解和谷胱甘肽代谢。

Heatmap分析显示，L345-0044处理后L-酪氨酸、左旋多巴、纤维二糖、D-葡萄糖1-磷酸、乙酰乙酸和酪胺化合物的表达显著上调(P< 0.05)(图3A)。通过对24H_vs_L24H中上调的差异代谢物进行富集分析，筛选出6条显著富集的通路，如酮体的合成和降解、淀粉和蔗糖代谢、丁酸代谢(图3B)。对24H_vs_L24H中下调的差异代谢物进行富集分析，筛选出5条显著富集的通路，如亚油酸代谢和苯丙氨酸代谢(图3C)。

以上结果表明L345-0044处理显著影响了酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢通路，并提高了参与这些通路的L-酪氨酸、左旋多巴、纤维二糖、D-葡萄糖1-磷酸和酪胺的含量。

图2草菇子实体的非靶向代谢组学分析

图3显著差异代谢物(SDMs)的热图和KEGG富集分析

3.代谢组和转录组联合分析

对24H_vs_L24H中SDMs和DEGs进行相关性分析 (图4A)。EC注释显示，酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶是相关性最强的两种酶(图4B)。24H_vs_L24H中上调的相关DEGs在糖酵解/糖异生和丙酮酸代谢通路富集(图4C)。24H_vs_L24H中下调的相关DEGs在氨基糖和核苷酸糖代谢以及淀粉和蔗糖代谢通路富集(图4C)。

24H_vs_L24H中相关SDMs(>3)的热图分析显示，L-酪氨酸、左旋多巴和D-葡萄糖1-磷酸显著上调(图4D)。通过对24H_vs_L24H中相关的SDMs进行通路富集分析，筛选出5条显著富集的通路，如酮体的合成和降解、酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、丁酸代谢(图4E)。通路(ko00350)显示，L-酪氨酸(C00082)、酪胺(C00483)、左旋多巴(C00355)和乙酰乙酸(C00164)参与了酪氨酸的代谢。L-酪氨酸在酪氨酸酶作用下形成左旋多巴和多巴醌，表明酪氨酸酶在低温自溶中的作用。通路(Ko00500)显示D-葡萄糖1-磷酸 (C00103)和纤维二糖(C00185)参与淀粉和蔗糖的代谢。此外，β-葡萄糖苷酶催化纤维二糖水解生成D-葡萄糖，表明β-葡萄糖苷酶在低温自溶过程中的作用。

图4 24H_vs_L24H组DEGs与SDMs的相关性分析

4.酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶的表达及活性验证

酪氨酸酶的热图分析如图5A所示。在24H中，只有VVO_03657表达上调。qPCR也证实了VVO_03657在24H中异常高表达(图5B)。通过分子模拟获得VVO_03657的三维结构，VVO_03657与A. bisporus tyrosinase (PDB code:4OUA)的序列一致性达到了23%。酪氨酸酶活性验证显示L24H组的酶活性最低(图5C)，说明L345-0044处理降低了酪氨酸酶活性。酪氨酸酶WB分析显示CS降低了L24H中酪氨酸酶的含量(图5H)，说明L345-0044处理抑制了酪氨酸酶的表达。

β-葡萄糖苷酶的热图分析显示，L345-0044处理后L24H中β-葡萄糖苷酶的表达下调(图5D)。我们重点研究了一些在24H中表达上调的β-葡萄糖苷酶基因，qPCR也证实其在24H表达上调，尤其是BGVV1 (VVO_08574)高度表达(图5E)。β-葡萄糖苷酶的活性验证表明，酶活性的均值在24H时最高(图5F)。利用SignalP 5.0进行蛋白信号肽预测，发现BGVV1具有信号肽的概率为93.193%，表明BGVV1是一种胞外酶。通过分子模拟获得BGVV1的三维结构，发现BGVV1与水稻β-葡萄糖苷酶(3GNR)的序列一致性达到31%(图5G)。β-葡萄糖苷酶的WB实验表明，大约70-kD的条带在24H组消失(图5H)，BGVV1的分子量为71.35 kDa。上述结果表明，CS胁迫在24H时促进胞外β-葡萄糖苷酶的分泌，如BGVV1。

图5 酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶的表达及活性验证

5.防冻试验

我们证实了GCase可以通过抑制β-葡萄糖苷酶的活性来提高草菇的CS耐受性。但是，GCase的食品安全问题限制了其在食品保鲜中的应用。DGase作为食品添加剂也是β-葡萄糖苷酶的有效抑制剂。防冻实验表明，在CS胁迫时，用DGase浸泡过的草菇子实体形状更饱满、颜色更亮、硬度更大，明显优于H2O处理。

CS胁迫48h后，与H2O相比，DGase处理后子实体形状保持较好。而且DGase价廉易得，可广泛用于草菇子实体的低温保存。

图6 草菇子实体的防冻试验

结论

本研究采用UMI绝对定量转录组分析和代谢组学方法，在4℃条件下对UBEV2抑制剂处理的草菇子实体的基因和代谢物进行差异分析。多组学结果表明，L345-0044处理增强了24H_vs_L24H中酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢。24H_vs_L24H中DEGs和SDMs的相关性分析表明，酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶是相关性最强的两种酶，分别参与酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢通路。qPCR证实胞外BGVV1和VVO_03675高度表达。WB和酶活实验表明，CS可诱导胞外BGVV1的分泌，并提高酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶的活性。防冻试验和酶活实验表明，β-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂可以通过降低酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶的活性来提高草菇的CS耐受性。DGase作为一种廉价的食品添加剂，可广泛用于草菇的保鲜贮藏。

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