mRNA疫苗的恩怨情仇：科学、知识产权以及金钱的名利场

在2020年COVID-19大流行期间，mRNA疫苗一鸣惊人。目前全球有数亿人接种了mRNA新冠疫苗，仅在2021年，这些产品的全球销售额就将超过500亿美元。数百上千名科学家历经数十年的努力，把mRNA疫苗从一个受人质疑的想法变成了临床现实 。mRNA疫苗的故事验证了许多科学发现成功的过程：几十年的死胡同、不断的被拒绝、无休止的利益争斗，但更多的还是科学家的慷慨、好奇心和以及对抗质疑的顽强毅力。 1

一锅分子浓汤开启了疫苗新时代

谁也不会想到，几十年前的这些略显简陋的实验会成为历史上最重要也是最盈利的两个疫苗的进身之阶。 1987年底，当时还是Salk生物研究所研究生的Robert Malone将mRNA与脂肪滴混合，炖了一锅分子汤。人的细胞从汤汁中吸收了mRNA，并开始从中产生蛋白质。Malone将实验记录下来，署名并注明日期。他认为这一发现将在医学上产生深远的影响，如果细胞能利用传递给它们的mRNA生成蛋白，那“RNA就可以作为药物用于治疗”。同年，马龙证明青蛙胚胎吸收了递送的mRNA。这是第一次有人使用脂肪滴来递送mRNA进入活体组织。  

图一：Malone手稿，记录1989年用合成mRNA给小鼠注射。图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w 

然而，在这之后很多年，mRNA不稳定性以及高昂的成本让Malone的愿望难以成真。几十个学术实验室和公司都在苦苦寻觅脂肪和核酸的完美结合，而这正是mRNA疫苗技术的基石。直到多年之后，mRNA疫苗的新技术才有了突破性的进展，包括化学修饰RNA和不同类型的“脂肪泡”递送系统。 自称为“mRNA疫苗发明者”的Malone认为他的工作没有得到足够的认可。他说：“我已经从历史中被消失了。”

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萌芽

其实Malone的工作并非空中楼阁。早在1978年，科学家们就已经使用一种叫做脂质体（liposomes）的脂肪膜结构，将mRNA转运到小鼠和人细胞中诱导蛋白的表达。只不过当时还不能人工合成mRNA，也无法预见mRNA作为药物的潜力。 1984年，发生了转机。这一年发育生物学家Douglas Melton领导的的小组（发育生物学家Paul Krieg在內）、哈佛大学的分子生物学家Tom Maniatis 和Michael Green应用RNA合成酶在实验室制造出具有生物活性mRNA， 这一合成mRNA核心方法一直沿用至今。随后，Krieg将实验室制造的mRNA注射到青蛙卵子中，结果证明合成mRNA工作原理与野生型mRNA一样。 当时，Melton 和Krieg仅把合成mRNA当作是研究基因功能和活性的一种工具。当Melton发现mRNA可以激活/阻碍蛋白的生产后，才开始探索如何使用合成RNA抑制目标基因的表达，并在1987年成立一家名为Oligogen的公司（后来的Gilead Sciences ）。 Krieg说：“RNA极其不稳定， RNA周围的一切都必须谨慎对待。”这或许也是哈佛大学不为该RNA合成方法申请专利的原因。于是这群哈佛的科学家们用这些试剂跟Promega换来了一点版税以及一箱香槟。Promega当时只是一家为研究人员提供RNA合成工具的实验室用品公司。  

图二：Paul Krieg (左) 和Douglas Melton (右) 在实验室合成了mRNA。图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w

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专利纠纷

几年后，Malone用哈佛团队的方法合成mRNA。但他添加了一种带正电荷的新型脂质体，以增强材料与mRNA主链（带负电荷）的结合能力。这种脂质体是由生物化学家Philip Felgner开发的，他现在是加州大学欧文分校疫苗研发中心的负责人。  

图三：Philip Felgner (左) 和Robert Malone.图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w Malone

成功地利用脂质体将mRNA递送至到人的细胞和青蛙胚胎中，却因与导师（Salk的研究员Inder Verma）闹翻，憾失博士学位。离开Salk后，Malone加入了一家新成立的初创公司Vical，为Felgner工作。他们和University of Wisconsin-Madison的合作者证明Lipid-mRNA复合物可以刺激老鼠体内蛋白的产生。另外 Malone和他的Vical同事还探索了将mRNA用于疫苗的可行性：他们早期的专利申请描述了将编码HIV蛋白的mRNA注射到小鼠体内，尽管没有产生特定的免疫细胞或分子，但是观察到一些对感染的保护。这项研究从未公布过。 之后的事情变得有点糟糕。1989年3月，Vical(与威斯康辛大学)和Salk都提出专利申请，但Salk很快就放弃了。90年，Verma也加入了Vical的顾问委员会。Malone声称，Verma 和Vical达成了一项幕后交易，致使相关知识产权落入Vical囊中。他虽然是发明家之一，却不能在随后的授权交易中获益。Malone说:“他们靠我的思想致富。” 但这一指控被Verma 和Felgner纳断然否认。Verma说放弃专利申请是Salk的决定。1989年Malone因Vical“没有充分认可他的贡献“愤然辞职。他试图继续mRNA的研究，但苦于缺乏资金，只好转向DNA疫苗及其递送系统的研究。2001年，他开始从事商业和咨询工作。 今日，这位先驱开始公开抨击mRNA疫苗的安全性。他宣称疫苗产生的蛋白会损害人体细胞，对于儿童和年轻人弊大于利。这些论调已经被其他科学家和卫生官员多次驳斥。

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制药业的挑战

1991年，Vical与世界上最大的疫苗开发商之一美国Merck签订了价值数百万美元的研究合作和许可协议。Merck试图在老鼠身上制造mRNA流感疫苗，但终因生产成本和可行性放弃了。 一家名为Transgène的小公司（Strasbourg, France）与Merck的想法不谋而合。Pierre Meulien当时在这家公司，他领导的小组与合作者在1993年首次证明了脂质体中的mRNA可以在小鼠体内引发特定的抗病毒免疫反应。Transgène申请了专利，并继续mRNA疫苗研究。Meulien现在是Innovative Medicines Initiative的领导者，他说优化技术平台至少需要1.2亿美元，他不能要求老板们为这个昂贵的“复杂的、高风险”的项目买单。该专利在Transgène的母公司决定停止支付费用后失效。Meulien的团队转向DNA疫苗和其他基于载体的输送系统。DNA平台最终产生了一些供动物使用的疫苗。  

图四：Pierre Meulien.图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w 

2021年秋，印度监管机构紧急批准了全球首个人DNA疫苗，用于预防COVID-19。鉴于对其一知半解， DNA疫苗在人身上的应用还是遥遥无期。尽管如此，业内人士认为对DNA疫苗技术的推动有利于mRNA疫苗的发展。DNA疫苗的生产、调控、序列设计以及分子水平研究，都可供mRNA借鉴，为RNA的成功奠定了基础。

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坚持不懈的努力

在1990s～2010s的二十年期间，几乎所有考虑mRNA疫苗的公司都因mRNA的不稳定性以及生产的成本而却步。幸运的是当时的肿瘤界的科学家们开始探索mRNA用于抗癌的潜力。如果将编码肿瘤特定蛋白的mRNA注射到体内，可能诱导免疫系统攻击这些癌细胞。基因治疗学家David Curiel在老鼠身上取得了一些成功。但当他试图与Ambion公司接洽时，则被当头一棒击，Ambion说没有看到这项技术的任何经济潜力。 另一方面癌症免疫学家Eli Gilboa 取得了较大的成功，并且在1997年成立了第一家mRNA疗法公司。Gilboa和他的杜克大学医学中心的同事们在老鼠血液中提取免疫细胞，使其吸收合成编码肿瘤蛋白的mRNA，然后将这些免疫细胞回输体内，调动机体免疫系统来攻击潜伏的肿瘤。到20世纪90年代末，Gilboa的学术合作者启动了人体试验，Gilboa的分拆公司Merix Bioscience（后来改名为Argos Therapeutics，现在改名为CoImmune）很快进行了自己的临床研究。这方法看起来颇有前景，但几年之后，候选疫苗后期大型试验的失败宣告这个想法的落伍。 尽管失败，Gilboa的工作激发了两家德国公司CureVac和BioNTech的创始人对mRNA的兴趣。这两家公司是目前最大的mRNA公司。CureVac的Ingmar Hoerr和BioNTech的Uğur Şahin也想做和Gilboa同样的事情，即直接将mRNA注入人体。  

图五：CureVac 创始人Ingmar Hoerr (左) ，和创建第一家mRNA公司的肿瘤免疫学家Eli Gilboa (右)。图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w

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创业加速器

Hoerr是第一个取得成功的人。2000年Hoerr报告说直接注射可以在老鼠身上引起免疫反应，当时他还在德国Tübingen大学。同年，他创建了CureVac。但他的同行与投资者兴趣缺缺。在一次会议上，Hoerr展示了老鼠的早期数据，有一个诺贝尔奖得主站在第一排说：“你说的都是一派胡言（completely shit）。” 不过最终，Hoerr还是获得了资助。第一位人体试验的受试者是该公司当时的首席科学官Steve Pascolo，他给自己注射了mRNA。至今，他的腿上至今仍留有头大的白色疤痕，皮肤科医生曾对这些疤痕进行穿刺活检分析。不久之后，一项更正式的试验开始了，该试验涉及皮肤癌患者的肿瘤特异性mRNA。 Şahin和他的妻子，免疫学家Özlem Türeci，也在20世纪90年代末开始研究mRNA。他们在这项技术上坚持不懈了多年，申请了专利，发表了论文，也获得了资助。2007年Şahin向一个亿万富翁推介了一项商业计划：“如果成功了，这将是突破性的”。这次他获得了1.5亿欧元的种子资金。  

图六：BioNTech 的创始人Özlem Türeci (左) 和Uğur Şahin (右)。图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w   

同年，一家名为RNARx的mRNA初创公司获得了一笔美国政府提供的不到十万美金的小额资金。该公司的创始人就是生物化学家Katalin Karikó和免疫学家Drew Weissman，当时他们都在宾夕法尼亚大学工作。他们改变部分mRNA的编码，有助于合成mRNA躲过细胞的固有免疫系统防御。

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核心技术

上世纪90年代，在缺乏资金支持的情况下，Karikó一直在实验室里努力将mRNA转化为药物平台。1995年，即使因为资金申请屡屡失败被宾大降职减薪。Karikó还是留下来继续改进Malone的方案，并设法诱导细胞产生与治疗相关的复杂蛋白。 1997年，Weissman在宾大建立了实验室，她开始与Weissman计划共同开发一种基于mRNA的艾滋病疫苗。当mRNA注射到老鼠体内时，他们观察到大规模的炎症反应。两个人很快就找到了原因:合成的mRNA激活了Toll-like受体，引发了一系列的免疫反应。2005年，二人重排了mRNA尿苷上的化学键，制造出一种新的类似物～伪尿苷，伪尿苷似乎能阻止人体对合成mRNA的防御。  

图七：Katalin Karikó （左）和Drew Weissman（右）。图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w 

科学界很快就意识到这些修饰核苷酸的治疗价值。2010年9月，干细胞生物学家Derrick Rossi和他的团队应用修饰mRNA将皮肤细胞转化为胚胎样干细胞，再转化为收缩的肌肉组织。Derrick Rossi的工作在当时引起轰动，被《时代》杂志评为2010年“重要人物”之一。他与人合伙创办了公司，名为Moderna。 Moderna想购买Karikó和Weissman的修饰mRNA专利的许可（2006年由宾大申报）。但为时已晚。2010年2月，一家小型实验室试剂供应商（后来的Cellscript）以30万美金获得RNARx授予的独家专利权。Cellscript将从Moderna和BioNTech获得数亿美元的再许可费。Moderna和BioNTech是首批COVID-19 mRNA疫苗的发起者，两种疫苗都含有修饰mRNA。

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伪尿苷的争论

Karikó和Weissman的发现是否重要，直至今日都是颇具争议的话题。 Moderna一直使用的是修饰的mRNA，Moderna的名字就是modified mRNA 的合成词。但也有一些公司没有采用这个技术。比如在马萨诸塞州的一家制药公司Shire，就认为只要添加正确的“帽状”结构并去除所有杂质，mRNA就无需修饰。后来Shire将Shire后来将其mRNA投资组合出售给了Translate Bio。Translate有一些人体数据表明其mRNA不会引发令人担忧的免疫反应，不过其COVID-19候选疫苗处于早期临床试验阶段，仍有待验证。 CureVac的免疫缓解策略是改变mRNA的基因序列，以最大限度地减少疫苗中尿苷的数量。这个方法似乎可行，CureVac针对狂犬病和COVID-19的实验性疫苗的早期试验都获得成功。但2021年6月，一项后期试验的数据显示，CureVac的COVID-19候选疫苗的保护性远远低于Moderna或BioNTech。 中国苏州艾博生物（Abogen）的CEO英博博士则认为影响mRNA疫苗的安全性和有效性的因素有很多，mRNA化学修饰只是其中之一。艾博有一款COVID-19 mRNA疫苗 ARCoV，未使用修饰的mRNA。2022年1月24日《柳叶刀》子刊公布该疫苗临床一期结果：耐受性良好，体液与细胞免疫反应强烈。

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脂质体的突破

许多专家强调了一项对mRNA疫苗的成功至关重要的创新：脂质纳米颗粒(LNPs)，即用微小脂肪泡包装保护mRNA，并将其运送到细胞中。 这项技术来自生物化学家Pieter Cullis（University of British Columbia in Vancouver, Canada）的实验室和他的公司。从20世纪90年代末开始，他们率先使用LNPs来递送核酸链来沉默目的基因。其中名为patisiran的此类疗法已获批用于一种罕见的遗传性疾病的治疗。2012年，Cullis的两家公司转向探究LNP传递系统在mRNA类药物中的应用。由首席执行官Thomas Madden 领导的Acuitas Therapeutics就与Weissman在宾大的团队以及几家mRNA公司建立了合作关系，测试不同的mRNA-LNP配方。BioNTech和CureVac的COVID-19的mRNA疫苗中就用了其中的一种配方。Moderna的LNP配方也没有太大不同。  

图八：Pieter Cullis.图片源自doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02483-w 

纳米颗粒由四种脂肪分子混合而成:其中三种有助于结构稳定性；第四种被称为可电离脂质，是LNP成功的关键。这种物质在实验室条件下是带正电荷的，这一点与在20世纪80年代末Felgner开发和Malone测试的脂质体类似。但是不一样的是Cullis和他的商业合作伙伴开发的可电离脂质在生理条件下(比如在血液中)转化为中性电荷，从而减少了对身体的毒性。此外，四脂质的鸡尾酒配方不仅延长了疫苗保存期，也增强了在体内的稳定性。 到2000年中期，人们设计了一种“T型接头”装置，使脂肪(溶解在酒精中)与核酸(溶解在酸性缓冲液中)两种溶液“同流合并”，这些组分会自然形成了密集的LNPs。这是目前最为可靠的一种制造mRNA药物的技术。一旦所有的部分整合在一起，“我们终于进入了一个可扩展的进程。” Andrew Geall说，他现在是圣地亚哥Replicate Bioscience的首席开发官。2012年， Geall领导的团队了首次将LNPs与RNA疫苗结合起来。 现在，每一家mRNA公司都在使用这种LNP递送平台和制造系统的一些变体，只是专利权的归属仍然是纠纷的热点。例如，Moderna与Arbutus Biopharma （Cullis在温哥华的一家附属企业）陷入了一场所有权争夺战，争夺Moderna的COVID-19疫苗所应用的LNP技术所有权。

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一个行业的诞生

到2000年代末，几家大型制药公司开始进军mRNA领域。2008年，诺华和Shire都建立了mRNA研究部门，其中前者专注于疫苗，后者专注于治疗学。2012年，美国国防高等研究计划署决定资助工业界研究RNA疫苗和药物，在这一举动的推动下BioNTech和其他的初创企业纷纷加入了竞争，包括后来大出风头的Moderna。2015年，Moderna筹集了10亿美金，承诺应用 mRNA诱导体内细胞自己制造药物，以治愈因缺失/缺陷蛋白而引起的疾病。在这一目标失败后，在首席执行官Stéphane Bancel的带领下，Moderna退而求缓，转而生产疫苗。 在COVID-19大流行之际，Moderna在病毒基因组序列上线后几天内就研制出了原型疫苗。随后又与美国国家过敏和传染病研究所合作，10周之内完成小鼠实验并启动人体试验。BioNTech也全员参与。2020年3月与辉瑞联手，以破天荒的速度开展临床试验，从首次人体试验到获得紧急批准，只用了不足8个月。这两种获批疫苗都使用修饰mRNA以及LNPs递送方式，都包含编码SARS-CoV-2刺突蛋白的一种形式的序列，这种形式的刺突蛋白的形状更易于诱导保护性免疫。

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mRNA疫苗的GMP生产

mRNA疫苗的生产速度快，流程工艺相对简单。mRNA的GMP生产流程始于DNA模板生产，之后的步骤与实验室合成RNA相同。生产所需的所有原料，包括质粒DNA、噬菌体聚合酶、capping酶和NTPs都有GMP级可溯源的商品化货源。这些原料均为化学合成品或由细菌表达，且无动物成分，这也避免了因来自细胞培养的安全隐患。 但是有些原料因生产规模有限而造成生产成本极高，这无疑极大的阻碍了mRNA疫苗的推广，这一问题随着mRNA疗法的商业化和生产规模的扩大而日益突出。近十几年来，宜明细胞（Ubrigene）一直专注于临床级GMP质粒的大规模平台化生产工艺开发，致力解决GMP质粒大规模生产的种种难题。

独立的GMP质粒生产车间，可提供高纯度、高活性、mg～g级的GMP质粒

成熟的高密度发酵工艺，产量高达1g/L发酵液，发酵规模可达200L，一次性完成数十克至上百克的质粒制备

全程参数控制的连续流碱裂解工艺，极大地提高了裂解效率、裂解菌量可线性扩大

创新的两步纯化工艺，高效地去除各类杂质，极大地缩短开发周期

对于整个行业来说，mRNA疫苗走到“前台”，将成为引发药理革命的重要时刻。回顾过去，许多人说他们很高兴mRNA疫苗正在改变人类生活。Cullis说:“这是数百上千人共同努力的结果，我们制造这个系统（LNPs），正是为了等待这个黄金时刻。”mRNA技术正在以难以置信的速度应用于其他重要领域，特别是癌症治疗。正如Karikó所说:“每个人都在不断地添加一些东西，包括我。”

 Ref： 1.https://www.nature.com/articles/d41586-021-02483-w 2.https://www.nature.com/articles/s41573-021-00283-5 3.https://www.nature.com/articles/nrd.2017.243 4.  https://mp.weixin.qq.com/s/kTjivNf2LyoS5FfeQ-XodA 

来源|宜明细胞 作者|Dr.Yang

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