极低出生体重早产儿的肠道微生态失调、细菌定植和易位

编译：微科盟京墨，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

肠道微生态失调常发生在新生儿败血症之前，但目前对其关联性仍不甚了解。本研究的目的是调查肠道菌群与新生儿败血症之间的关系，并寻找疾病演变为侵袭性感染之前肠道内致病菌定植的证据。本研究设计了一项前瞻性队列，检查了患或不患败血症的早产儿的粪便菌群组成。32名极低出生体重（very-low-birth-weight，VLBW）的早产儿和10名作为对照的健康足月婴儿被纳入研究。收集参与者出生后第1、第4和第7周的粪便样本并进行16S rRNA扩增测序，以测量菌群的多样性和组成。对分离出的引起新生儿败血症的细菌进行了基因组测序和PCR以确认细菌从肠道转移到血液中的情况。结果显示，与没有败血症的早产儿和足月儿相比，患有败血症的VLBW早产儿出生时肠道内的菌群多样性较低。早产儿的肠道菌群的组成在出生时与健康婴儿相似，但在几周后却朝着微生态失调的方向发展，表现为变形菌门（Proteobacteria）增加，厚壁菌门（Firmicutes）减少。菌株特异性PCR证实，10个患有败血症的VLBW早产儿中，有4个（40%）在败血症发病前或发病时肠道内存在致病菌，并且在抗生素治疗后数周内仍有相关菌株存在。类似的细菌菌株可以水平传播，引起其他婴儿的感染。长期的抗生素暴露明显减少了肠道中有益的双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳酸杆菌（Lactobacillus）。总之，肠道微生态失调的早产儿有患新生儿败血症的风险，致病的病原体可能来自肠道，并持续进行横向传播。变形菌门丰度增加和菌群多样性减少的关联性表明，有必要针对肠道菌群进行干预，以防止VLBW早产儿的微生态失调和败血症。

 论文ID

 原名：Gut Dysbiosis, Bacterial Colonization and Translocation, and Neonatal Sepsis in Very-Low-Birth-Weight Preterm Infants 

译名：极低出生体重早产儿的肠道微生态失调、细菌定植和易位以及新生儿败血症

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：5.64

发表时间：2021年10月7日

通讯作者：邱政洵

通讯作者单位：长庚大学医学院，台湾桃园长庚纪念医院

DOI号：10.3389/fmicb.2021.746111

实验设计

结果

1 研究参与者的临床特征

从2018年8月到2020年10月，44名VLBW早产儿参加了这项研究。我们排除了10名在产后第1周内没有粪便产生的婴儿，1名错过了第3次粪便收集时间的婴儿，以及1名在第2次粪便收集后死于肺高压所致肺气肿的婴儿。最后，登记了32名VLBW婴儿和10名健康期婴儿。10名早产儿发生了12次侵入性细菌感染，他们的粪便样本被归类为早产侵入性组（PI）。来自22名没有侵入性感染的早产儿的其他粪便样本被归类为早产非侵入性组（PNI）。来自足月婴儿的粪便样本被归类为为健康足月组（HT）。临床信息汇总于表1中。PI组早产儿母亲的平均妊娠年龄相对于PNI组的早产儿较年轻（26.9±2.2 vs 28.7±2，p=0.027），但两组的平均出生体重相似（1021.6±283.4 vs 1155.8±161.4， p=0.188）。感染侵入性细菌的婴儿在第1周摄入的累计人乳、配方奶和总喂养量较少，但只有配方奶的差异具有统计学意义（表1）。第1周经验性使用抗生素的时间和益生菌使用比例在PI和PNI组间较为相似：直到第3个粪便收集周期（7周）的药物治疗持续时间 (Duration of Therapy，DOT) 在两组（表1）之间也没有显著差异。PI组的住院时间较长，但两组（表1）之间的差异在统计学上并不显著。

表1. 有/无新生儿败血症的非常低出生体重（VLBW）早产儿的临床信息。

注：a以平均值±标准差表示。b以中位数和四分位数范围（IQR）表示。第1周cHM：第一周内累积的人奶消费。第1周cRF：第一周内累计的配方奶消耗量。第1周cFeeding：第一周内的累计喂养量。第1周Abx：第一周内累计使用抗生素天数。DOTs：所有抗生素使用的治疗时间（天数）。

这些早产儿败血症所分离出的细菌列在表2中。9人血液感染，3人中枢神经系统感染。感染的致病菌3例（25.0%）为革兰阴性杆菌（GNB）、1例为革兰阳性杆菌（8.3%），8例（67.7%）由革兰阳性杆菌（GPC）引起。所有GPC都属于葡萄球菌（Staphylococcus）。患者C06发生了两种侵入性感染：一种在27天时由Staphylococcus capitis感染，另一种在48岁时由耐碳青霉烯的Serratia liquefaciens感染。另一名患者C38因患有脑积水接受脑室-腹腔分流术（VPS），并感染了两种明显的侵入性中枢神经系统 (CNS) 感染：一种是95天龄时的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）序列型（sequence type，ST）35，另一种是116天龄时的表皮葡萄球菌序列型59。多位点序列分析 (MLST) 分析显示，患者C03的感染也由表皮葡萄球菌序列型35引起，患者C28感染由表皮葡萄球菌序列型59引起。根据发病时间分类，12例侵入性感染包括1个早发败血症（Early⁃onset sepsis，EOS）、8个晚发败血症（Late⁃onset sepsis，LOS）和3个极晚发败血症（very late-onset sepsis，VLOS）。

表2. 病原菌导致10名早产儿出现12例新生儿败血症，采用重症监护措施，菌属比例与肠道菌群中的致病菌相同。

注：B，血液；CSF，脑脊液；EVD，脑室外引流；GNB，革兰氏阴性杆菌；GPB，革兰氏阳性杆菌；GPC，革兰氏阳性球菌；HFOV，高频振荡通气；IMV，间歇性机械通气；NA，不可用；NIV，无创通气；NPN，新生儿肠外营养；PCVC，经皮中心静脉置管；ST，序列类型；VPS，脑室腹腔分流。

  2 肠道微生态失调与新生儿败血症之间的关系

本文共收集了20份健康足月婴儿的粪便样本和96份VLBW婴儿的粪便样本进行了分析。图1显示了3组中的α-和β-多样性。根据Shannon指数，侵入性感染的婴儿（PI组）自出生起α-多样性就显著较低（P< 0.05），并持续到4和7周龄（图1B）。根据Chao1和Shannon指数，微生态失调持续到出生后7周（图1A，B）。无侵袭性感染的早产儿（PNI组）在出生时显示出较高的肠道微生物多样性，但在出生后，其多样性明显下降。健康婴儿（HT组）在出生时和之后保持较高的多样性（图1A，B）。β-多样性的分析（协变量调整的主坐标分析）显示各组之间有明显的变化（P< 0.001）（图1C）。在动态变化方面，我们发现HT组的菌群从出生到4周龄抑制保持稳定（图1C，上部的两个圆圈），但PI组和PNI组的菌群从出生到7周龄随时间发生变化（图1C，代表圆圈随时间从左下部移到右下部）。

 图1. 肠道菌群的α-多样性和β-多样性。α-多样性指数，包括Chao1（A）和Shannon指数（B），以及（C）健康足月儿（HT）、无侵入性感染的早产儿（PNI）和有侵入性感染的早产儿（PI）的肠道菌群的β-多样性（CPCoA，协变量调整主坐标分析）。HT1，出生后第1周内收集的粪便；PNI1和PI1，出生后第1周内收集的粪便；HT2、PNI2和PI2，出生后4周收集的粪便；PNI3和PI3，出生后7周收集的粪便。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns, 不显著。

图2、3分别显示了分类学概况和热图中主要门和属的比例。健康足月婴儿出生后（HT1）的肠道微生物区系与早产婴儿出生后（PNI1和PI1）的肠道微生物区系相似，其中变形菌门占40.3-48.8%，其次是厚壁菌门（23.9-29.5%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（10.9-28.4%）和放线菌门（Actinobacteria）（5.2-8.5%）。然而，在4-7周龄时，变形菌门的比例在HT2中下降到16.3%，但在PNI3和PI3中分别增加到72.8和80.3%。同时，厚壁菌门的比例在HT2中增加到42.6%，但在PNI3和PI3中分别减少到17.9和15.7%。这些趋势表明，早产儿的肠道菌群朝着微生态失调的方向发展，特别是在PI组。在属的层面上，早产儿中GNB【肠杆菌、埃希菌/志贺菌（肠杆菌属, Escherichia / Shigella）】的比例随时间推移而增加，并且PI组的增幅高于PNI组。3组中具有显著差异的菌种由图3显示。拟杆菌门是HT1中是最重要的门类，在PNI1中则是放线菌门，而在PI1中是变形菌门。

图2. 不同组别婴儿中细菌分类群的丰度。各组粪便中细菌分类群的平均相对丰度（A）和属（B）。HT，健康足月婴儿；PNI，无侵入性感染的早产儿；PI，有侵入性感染的早产儿。

 图3. 肠道菌群的主要组成比例和LefSe分析。用热图表示每组参与者的门（A）和属（B）的水平。(C) Cladogram图显示3组中具有显著差异的细菌物种。从内到外显示了门、类、目、科、属水平上的物种分类。系统发育树中的红色、绿色和蓝色节点分别代表在PI1、PNI1和PNI3组中发挥重要作用的细菌物种。黄色结点代表没有明显差异的物种。

  3. 抗生素使用对肠道菌群的影响

NICU的所有早产儿在住院期间都接触过抗生素。32名早产儿第3次采集粪便前的中位数DOT为20.5天（范围为4-77天）。从早产儿中收集的粪便样本，如果其DOT高于中位数，则被归入DOT>中位数组，其他则归入DOT<中位数组。采集的没有接触过抗生素的健康足月婴儿的粪便样本在出生后第4周（HT2）作为对照。侵入性感染率在DOT<中位数组和DOT>中位数组的婴儿之间没有显著差异（25.0% vs. 37.5%，p = 0.70）。

研究分析了粪便样本的菌群，以评估抗生素使用对肠道菌群的影响。早产儿（DOT<中位数和DOT>中位数）的α-多样性（Chao1和Shannon指数）明显低于健康足月婴儿（HT2）（图4）。β-多样性的分析也显示，在HT2、DOT<中位数和DOT>中位数组中，肠道内的菌群组成有明显的不同（P < 0.001）（图4）。图5和图6（原文中图S1）显示了健康婴儿和早产儿之间根据抗生素暴露而产生的肠道菌群的差异。健康婴儿的主要门类是厚壁菌门（42.6%）、放线菌门（26.8%）、变形菌门（16.3%）和拟杆菌门（14.3%）；然而，DOT<中位数组和DOT>中位数组的主要门类是变形菌门（分别为71.7%和78.3%）和厚壁菌门（分别为18.7%和15.7%），而拟杆菌门的比例在两者中较低（图5）。在属的层面上，健康方面的前5个主要属是双歧杆菌属（26.5%）、韦荣氏球菌属（Veillonella）（15.6%）、拟杆菌属（Bacteroides）（11.2%）、埃希氏菌属/志贺氏菌属（10.2%）和链球菌属（Streptococcus）（9.7%），而在DOT<中位数组和DOT>中位数组中，主要的菌属是肠杆菌属（Enterobacter）（分别为46.3%和46.7%）、埃希氏菌属/志贺氏菌属（分别为17.7%和24.4%）和双歧杆菌属（分别为9.5%和5.7%）。DOT>中位数组的肠道菌群由明显多于其他组的肠杆菌属和假单胞菌属（Pseudomonas）等细菌组成（图6）（原文中图S1）。双歧杆菌属在健康组、DOT<中位数组和DOT>中位数组中分别占26.5、9.5和5.7%。乳杆菌属在HT2、DOT<中位数组和DOT>中位数组中分别占7.4、2.5和<0.1%。因此，长期接触抗生素并没有减少肠杆菌属和假单胞菌属的细菌比例，但减少了肠道中的益生菌，如双歧杆菌属和乳杆菌属。

图4. 肠道菌群的α-多样性和β-多样性。α-多样性指数，包括Chao1（A）和Shannon指数（B），以及（C）4周龄健康足月儿（HT2）和DOT低于中位数（DOT<中位数）和DOT高于中位数（DOT>中位数）的早产儿肠道菌群的β-多样性（CPCoA，协变量调整主坐标分析，CPCoA）。*P<0.05；**P<0.01；ns，不显著。

 图5. 不同抗生素暴露水平的早产儿之间的细菌分类群丰度。各组粪便中细菌分类群的平均相对丰度（A）和属（B）水平。HT2，4周岁的健康足月婴儿；DOT<中位数组，DOT低于中位数的早产儿；DOT>中位数组，DOT高于中位数的早产儿。

 图6 LefSe分析。树状图显示了3组中存在显著差异的细菌种类（见图4和图5）。系统进化树中的绿色和红色节点分别代表在DOT<中位数组和DOT>中位数组中起重要作用的细菌种类。黄色节点代表无显著差异的细菌物种（原文中图S1）。

  4. 肠道菌群中发现的致病菌菌株

表2和附图2-5总结了与败血症致病菌相同的细菌种类在肠道菌群中的比例，大便PCR的结果见表3。与致病菌相同的细菌种类在3个患有败血症的早产儿（C08、C28和C44）的肠道菌群中占优势。患者C08在第2次和第3次粪便采集之间出现了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的LOS，并且克雷伯菌属的比例从第1次粪便样本的43.9%持续增加到第2次和第3次粪便样本的82.4%和93.3%（表2和附图2，克雷伯菌）。致病性K. pneumoniae仅在第2和第3份粪便样本中通过PCR检测到，这表明第1份样本中存在的K. pneumoniae可能不是致病性的（表3）。患者C44的母亲曾因大肠杆菌引起绒毛膜炎（数据未显示），而患者C44在第1次粪便采集前因大肠杆菌引起EOS。菌群显示，在第一次、第2次和第3次粪便样本中，大肠杆菌属分别占99.8%、1.8%和44.9%（表2和附图3，大肠杆菌）。在第1个粪便样本中确实检测到了致病性大肠杆菌。经过抗生素治疗后，大肠杆菌在第2份粪便样本中消失了；但是，在第3份粪便样本中又出现了（表3）。患者C22因出血性脑积水后进行了脑室外引流（EVD），出现了LOS和EVD分流器被金黄色葡萄球菌感染。属级的菌群显示，葡萄球菌在3个粪便样本中仅占0.3、0.3和2.4%（表2和附图4，葡萄球菌）。PCR证实，致病性金黄色葡萄球菌存在于第2和第3个粪便样本中（表3）。患者C28在第3次粪便采集后出现了表皮葡萄球菌的LOS。肠道微生物组成中的葡萄球菌在3个粪便样本中分别为93.4%、1.1%和0.1%（表2和附图5，葡萄球菌）；然而，PCR证实在第2次粪便采集中存在致病性表皮葡萄球菌（表3）。

表3. PCR鉴定从患有败血症的早产儿收集的粪便样本中的病原菌。 

注：两个独特的引物P1和P2被用来识别粪便样品中每个细菌分离物的特定序列。引物细节列于附表1。EOS，早发败血症；LOS，晚发败血症；VLOS，极晚发败血症。

a分离的细菌菌株在PCR检测中作为阳性对照。b 早产儿的第1、2、3次粪便样本分别在出生后第1、4、7周内采集。c 随机选取3个健康足月婴儿的粪便样本作为PCR检测的阴性对照。d 只在随机挑选的3个健康足月婴儿的粪便样本中的1个呈阳性。

  5. 菌种特异性PCR的结果

利用细菌分离物的基因组序列设计了菌株特异性引物，并对粪便样本进行PCR，以追踪病原菌的动态变化。结果明确区分了致病菌繁殖和同一物种的定植细菌。C08、C22和C28的LOS患者以及C44的EOS患者的肠道中的致病菌定植得到了证实（表3）。在研究期间，NICU爆发了蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，B. cereus）败血症。蜡样芽孢杆菌被证实来自被污染的床单（数据未显示）。本研究在患者C42的粪便样本中没有发现蜡样芽孢杆菌，表明其来自于环境（表3）。

用菌种特异性引物进行的PCR也检查了不同患者的相同基因型的致病菌是否是相同的菌株。MLST显示，S. epidermidis ST35对C03和C38（第一次感染）的感染有贡献，而S. epidermidis ST59对C28和C38（第2次感染）的感染有贡献。PCR的结果表明，C28和C38（第2次中枢神经系统感染）患者脑积水与VPS感染的S. epidermidis ST59是相同的，两者都由相同的菌株特异性引物鉴定（表3）。值得注意的是，这两次感染相隔近5个月，而且在患者C38的任何粪便样本中都没有检测到S. epidermidis ST59。此外，PCR证实来自患者C03和C38（第一次中枢神经系统感染）的S. epidermidis ST35属于不同的细菌来源，因为菌株特异性引物只识别这些引物所产生的细菌产物（数据未显示）。

讨论

一般认为肠道菌群的发展是从出生开始的，尽管一些研究在羊水、胎盘样本和胎粪中检测到微生物。在这项研究中，我们发现早产儿和足月儿出生后的肠道菌群组成相似，两者最常见的门类是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。然而，与足月儿中厚壁菌门和放线菌门的增加不同，早产儿的变形菌门在出生后的几周内明显增加。这一现象在之前的报告中被发现，早产儿的肠道菌群在出生后的第1周内迅速被变形菌门类主导，并在出生后的第1个月内保持高水平。如果早产儿在产后对足月儿赶上生长，他们是否以及何时会最终遵循类似的发育模式仍是未知数。我们在这项研究中还发现，在菌群组成中，受感染的早产儿的肠道比未受感染的早产儿携带更多的潜在致病菌，而益生菌较少。

新生儿败血症前期的新生儿的肠道菌群因时间和研究地区不同而不同。早期的文献显示，部分由于长期使用抗生素而导致的低多样性的肠道菌群可能与败血症有关。在出生后2天内接受抗生素治疗的婴儿的肠道菌群中，变形菌门的比例明显较高，放线菌门（主要是双歧杆菌属和乳杆菌属）的比例明显较低。本研究的结果也支持这些观点。患有侵袭性感染的VLBW早产儿出生后的菌群多样性较低。出生后，微生物多样性与抗生素暴露的时间成反比。此外，长期使用抗生素明显减少了肠道中有益的双歧杆菌属和乳杆菌属。因此，肠道菌群失调是新生儿败血症发展的1个主要风险因素，肠道菌群的早期变化可作为预测或预防败血症的标志物。

EOS的生物体通常是母体泌尿生殖道的定植者，导致羊水、胎盘、子宫颈或阴道污染，继而引起羊膜内感染。LOS和VLOS的发病机制仍有争议，据推测，致病菌可能从环境或以前在肠道中定植的细菌侵入到血液中。在我们的研究中，在12例败血症中，唯一的大肠杆菌感染的EOS是由母亲的绒毛膜羊膜造成的。母亲的绒毛膜羊膜炎。其他8例LOS和3例VLOS主要由Staphylococcus引起，这与之前的观察一致，即VLBW新生儿中最主要的生物体是凝固酶阴性葡萄球菌，这可能与医疗设备有关或是独立发生。

这项研究对新生儿败血症的机制有了新的认识，并提供了可能的预防策略。首先，用菌株特异性引物进行的PCR证实，在3名患者出现败血症之前，他们的肠道内有病原菌的定植，这表明细菌从肠道转移到血液中。其次，两名患者C28和C38（2次中枢神经系统感染）是由同一细菌菌株引起的，但在C38的粪便中没有检测到该菌株，暗示后者的感染可能来自环境。这两次感染相隔近5个月，表明该细菌病原体可能在环境中持续存在，或在未感染的住院婴儿或医务人员中定植。有类似的报告指出，肠道定植是水平传播和随后感染周围病人的主要风险因素。因此，在NICU中应加强感染控制措施和侵入性感染发生后的环境监测。第三，尽管有抗生素治疗，但细菌菌株在患者C08（EOS）和C44（LOS）的粪便中持续存在，增加了水平传播的风险。致病菌在肠道内持续定植，这凸显了洗手对防止新生儿重症监护室内细菌传播的重要性。第四，利用带有菌株特异性引物的PCR技术，我们区分了由相同基因型的不同细菌菌株引起的两种感染。分子检测方法有助于调查NICU中的LOS群。我们的研究表明，住院早产儿LOS的致病菌可能来源于肠道内的定植菌或从环境中横向传播获得。

我们研究的优势在于提供了有无败血症的足月儿和早产儿之间的肠道菌群组成的信息。除了基因组分析外，我们还使用特异性PCR来证明肠道内存在致病菌，并区分具有相同基因型的细菌。也有一些不足之处：首先，每个病人只有3次粪便采集，限制了对新生儿细菌定植时间的调查；其次，入选的VLBW早产儿只占住院病人的一小部分，从而限制了对致病菌和传播方式的全面调查；第三，考虑到健康足月婴儿处于成熟和稳定的状态，我们没有采集他们在出生后第7周的粪便样品进行检查。尽管如此，该研究还是提供了证据，证明了3个月以内的早产儿的新生儿败血症的病原菌的传播动态。

结论

研究表明，患有肠道发育不良的VLBW早产儿有患新生儿败血症的风险，病原体可能是以前在肠道中定植或由于环境中的水平传播获得的细菌。长期抗生素暴露是早产儿肠道微生态失调的重要原因。菌群分析表明，有必要针对肠道菌群进行干预，以防止VLBW早产儿出现微生态失调和败血症。

打赏