红花黄色素可通过调节肠道菌群，减少DEN诱导的肝癌

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

红花黄色素（SY）是从中药红花中提取的主要活性成分，是一种珍贵的天然食用色素，广泛用于治疗脑血管和心血管疾病。然而，SY对肝细胞癌（HCC）的影响尚不清楚。在这项研究中，我们发现SY降低了二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝癌小鼠模型肝脏的损伤程度并抑制了炎症因子的释放。流式细胞术和免疫印迹显示SY通过影响胶原纤维的表达，增加CD8+T细胞和Gr-1+巨噬细胞的浸润，从而改善免疫微环境。进一步的细胞实验表明SY通过TGF-β/Smad信号通路降解肝细胞中的胶原。SY还可能调节有助于免疫微环境的肠道微生物群。综上所述，SY通过促进胶原降解和调节肠道微生物群，增强肝脏免疫浸润，从而对肝癌的发生发展显示出强大的作用。这项研究为SY作为未来肝癌治疗候选药物的机制提供了新的见解。

论文ID

原名：Safflower yellow reduces DEN-induced hepatocellular carcinoma by enhancing liver immune infiltration through promotion of collagen degradation and modulation of gut microbiota

译名：红花黄色素通过促进胶原降解和调节肠道菌群，增强肝脏免疫浸润，从而减少DEN诱导的肝癌

期刊：Food & Function

IF：5.396

发表时间：2021年9月29日

通讯作者：胡智明和寿旗扬

通讯作者单位：浙江省人民医院肝胆胰外科；浙江中医药大学附属第二医院

DOI号：10.1039/d1fo01321a 

实验设计

前言

肝细胞癌（HCC）是最常见的癌症之一，是世界上第三大癌症相关死亡原因。肝癌的治疗取决于疾病分期。手术是标准治疗方法，早期治疗患者的5年生存率为70%。对于晚期不能切除的肝癌，全身化疗是主要的批准治疗方法；然而，由于肝细胞固有的化疗耐药性，化疗只能产生非常有限的生存效益。根据以前的研究，大多数HCC是由慢性炎症和肝损伤引起的，它们被认为是炎症相关癌症的典型例子。肝脏炎症形成了一个强大的内在免疫抑制微环境，这可能是免疫治疗或化疗的障碍。因此，改善肝脏免疫抑制微环境以提高化疗敏感性对肝癌患者非常重要。

红花黄色素（SY）是从中药红花中提取的主要活性成分，由于其促进血液循环和祛瘀的能力，被广泛用于治疗脑血管和心血管疾病以及随后的创伤。研究表明，SY的生物活性包括抗氧化、神经保护和抗炎；它也是一种珍贵的天然食用色素。我们之前的研究表明，SY通过抑制肿瘤细胞的侵袭来预防乳腺癌的肺转移，这表明SY可能在抗肿瘤治疗中发挥重要作用。然而，SY对HCC的作用和机制尚不清楚。

在本研究中，我们全面调查了SY在调节肿瘤免疫微环境中的作用以及与环磷酰胺（CTX）联合治疗的疗效。我们的数据为肝癌患者提供了一种新的治疗方法。

结果

1 SY联合CTX可降低DEN-HCC模型中的肝癌发病率

我们评估了SY以及SY和CTX联合治疗DEN诱导的肝癌模型的潜在疗效。在本研究中，从第16周开始，DEN治疗降低了模型组、SY组、CTX组和联合组的小鼠体重（图1A）。SY和CTX联合用药组的存活率为90%，而单独服用SY或CTX的组的存活率仅为70%，与模型组相似（图1B）。肝脏H&E染色显示，模型组和SY组的癌症发病率分别为82%和55%，而SY+CTX组的发病率降低到20%（图1C）。此外，SY组结节的大小和数量远小于模型组（图1D）。与模型组相比，单用SY治疗可显著降低血清ALT、AST和ASP水平；用SY+CTX治疗可增强该效应（图1E）。与SY组一样，SY组和SY+CTX组的肝脏结节数量远低于模型组（图1F，黄色箭头和HE染色显示）。数据证实，SY可能在肝癌进展中发挥抑制作用，并可改善化疗（如CTX治疗）的效果。  

图1. 红花黄色素（SY）和SY联合环磷酰胺（CTX）抑制N-亚硝基二乙胺（DEN）诱导的肝细胞癌（HCC）。（A和B）实验期间小鼠体重变化和存活率。（C）小鼠肿瘤发病率的量化（肿瘤发病率=患肿瘤的小鼠数量/每组小鼠总数×100）。（D）小鼠肿瘤结节的定量分析。（E） 小鼠肝脏中的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平。（F）肝脏的照片和H&E染色；黄色箭头表示肝结节。模型：DEN-喂养组；SY：DEN和SY-喂养组；SY+CTX：DEN、SY和CTX喂养组。与对照组相比，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著。与模型相比，#P < 0.05为显著，##P<0.01为极显著。  

2 在DEN-HCC模型中，SY联合CTX抑制肝脏炎性细胞因子释放和胶原沉积

考虑到炎症在癌变过程中的重要性，我们分析了肝脏中的炎症因子。与对照组相比，模型组肝脏中的炎症因子水平，如TNF-α、IL-6、IL-10和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）显著升高，尽管IFN-γ和白细胞介素12P70（IL-12P70）没有显著变化。经SY和SY+CTX联合治疗后，IL-6和TNF-α水平降低（图2A）。此外，我们使用LPS刺激巨噬细胞的炎症反应来验证SY对炎症的影响。LPS诱导巨噬细胞上清液中高水平的炎症因子和细胞因子分泌；SY治疗可显著抑制分泌，其效果呈剂量依赖性（图2B）。Masson染色显示胶原纤维的表达（蓝色区域），表明肝纤维化。DEN治疗可诱导胶原纤维表达，而对照组未观察到这种情况。SY治疗可显著减少肝纤维化，联合治疗组的肝纤维化进一步改善（图2C）。这些结果表明，SY可以抑制DEN诱导的炎症，减少肝脏中胶原蛋白的形成，与CTX联合使用，这些作用可以增强。

 图2. 红花黄色素（SY）和SY联合环磷酰胺（CTX）抑制炎症因子和胶原积聚。（A） 通过流式细胞仪珠阵列（CBA）检测小鼠组肝脏中白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素12P70（IL-12P70）的水平。（B） 通过CBA分析检测巨噬细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-10、MCP-1、IFN-γ和IL-12P70的水平。（C） Masson三色染色观察胶原聚集；蓝色区域表示胶原蛋白积聚。模型：N-亚硝基二乙胺（DEN）喂养组；SY：DEN和SY-喂养组；SY+CTX：DEN、SY和CTX喂养组。与对照组相比，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著。与模型相比，#P< 0.05为显著，##P<0.01为极显著。

3 SY通过免疫CD8+T细胞和CD11b+Gr1+巨噬细胞促进肝脏浸润

用多色流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞的免疫细胞亚群。结果表明，SY促进了CD8+T细胞的浸润，但对肿瘤组织中的CD4+T细胞没有影响（图3A和C）。重要的是，CD8+T细胞浸润伴随着效应T细胞的增加，CD44+CD62L− 的存在证实了这一点（图3A和B）。我们检测了SY对具有免疫抑制功能的巨噬细胞的影响。如图3E所示，SY治疗组肝组织中F4/80+巨噬细胞的数量明显低于DEN模型组。据报道，与对照组相比，DEN模型组中抑制T细胞增殖的CD11b+Gr1+巨噬细胞显著增加。SY治疗后，CD11b+Gr1+巨噬细胞的数量显著抑制；CD11b+Gr1+髓源性抑制细胞（MDSCs）的百分比也有类似的变化。这些结果表明，SY可能通过调节免疫浸润和免疫抑制效应来降低HCC的发病率。  

图3. 红花黄色素（SY）治疗改善了肝癌的免疫微环境。（A）各组肝组织中CD8+T细胞的百分比（通过CD3+CD8+染色显示）。（B）CD8+效应T细胞的百分比（由CD44+CD62L表示− 染色）和肝组织中的记忆T细胞（由CD44+CD62L+染色指示）。（C）各组肝组织中CD4+T细胞的百分比（通过CD3+CD4+染色显示）。（D） CD4+效应T细胞的百分比（由CD44+CD62L指示−染色）和肝组织中的记忆T细胞（由CD44+CD62L+染色指示）。（E）F4/80+巨噬细胞的百分比（由CD45+CD3−指示染色）在肝组织中。（F）肝组织中CD11b+Gr-1+巨噬细胞的汇总百分比。（G）肝组织中CD11b+Gr-1+髓源性抑制细胞的汇总百分比。与对照组相比，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著。与模型相比，#P < 0.05为显著，##P<0.01为极显著。

4 SY通过抑制炎症反应促进细胞外基质的降解

为了研究SY治疗DEN诱导的肝癌后，介导肿瘤内CD8+T细胞浸润增加的机制，我们使用RNA测序分析检测了肝脏中的转录变化。热图分析显示对照组、模型组和SY治疗组中差异上调和下调基因的聚集（图4A和B）。为了确定DEN诱导HCC过程中涉及的信号通路，我们使用KEGG通路分析来显示各组之间的主要显著变化。图4C显示了前10个代表性路径。最重要的KEGG通路与炎症调节有关，如TNF信号通路、细胞因子和趋化因子。基于这些结果，我们推测SY可能抑制DEN诱导的HCC的炎症反应，从而抑制肝纤维化。 接下来，我们研究了SY对炎症基因表达的影响。结果显示，SY显著下调TNF-α、CXCL2和NF-κB p65的表达，而SY+CTX组的表达增强（图4D和E），肝脏炎症可在肝脏中产生成纤维细胞增殖和胶原沉积。然后，我们测量了肝组织中的胶原纤维相关蛋白的表达，如Col1、Col3、COL4和COL4，SL1008A。在模型组中，Col1、Col3和SL1008A的表达显著高于对照组，表明肝纤维化的发生率较高。由DEN引起的Col1、Col3和SL1008A的高表达在SY治疗组中受到抑制，但在联合治疗组中未受到抑制（图4F和G）。这些结果表明，SY可以通过调节DEN诱导的HCC中的TNF-α信号来抑制肝脏炎症，并影响胶原蛋白的表达以促进免疫浸润。

5 SY通过TGF-β/Smad信号通路抑制肝纤维化

为了研究SY治疗DEN诱导的肝癌后抑制纤维增殖和胶原生成的机制，我们研究了SY对胶原沉积的影响。在Hepa1-6细胞中，SY显著下调胶原蛋白表达，如Col 1和Col 3（图5A和B）。同时，与对照组相比，SY治疗后肝基质相关蛋白，如纤维连接蛋白和MMP9的水平也降低。这些结果与体内获得的结果一致。进一步研究表明，SY抑制TGFβ和Smad2/3的表达，从而刺激成纤维细胞增殖和胶原生成（图5C和D）。这些结果表明SY可以通过TGF-β/Smad信号通路消耗DEN诱导的HCC中的肝基质。  

图4. 红花黄色素（SY）治疗减弱N-亚硝基二乙胺（DEN）诱导的肝脏炎症反应，促进胶原纤维降解。（A和B）上调（A）和下调（B）的层次聚类分析各组肝脏中的基因。（C）肝脏相关通路的KEGG通路分析。（D）各组肝脏中NF-α、CXCL2和NF-κB p65通路的Western blot分析。（E）免疫印迹分析各组肝脏中Col1、Col3和SL1008A的表达。与对照组相比，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著。与模型相比，#P < 0.05为显著，##P<0.01为极显著。  

图5. 红花黄色素（SY）通过TGF-β/Smad信号通路去除肝基质。（A）通过western印迹测定MMP9、Col1、Col3和纤维连接蛋白的水平。（B）蛋白质表达水平的统计数据。（C）通过western印迹法测定TGF-β和Smad2/3的蛋白质水平。（D）蛋白质表达水平的统计数据。与对照组相比， *P <0.05为显著， **P <0.01为极显著。

6 SY对DEN-HCC小鼠肠道微生物群的影响

由于肠道微生物组在调节肿瘤免疫微环境和肝肿瘤发生易感性方面起着重要作用，我们对粪便内容物样本进行测序，以研究SY对肠道微生物结构的影响。首先，我们评估了三组中的操作分类单元（OTU），以确定共享和独特的物种。Venn图显示，在对照组的母鼠中有398个共享OTU，29个独特OTU，模型组有17个独特OTU，SY组的母鼠中有23个独特OTU（图6A）。分类成分分析显示，模型组小鼠严重的生物失调增加了拟杆菌和丹毒丝菌的数量，降低了杆菌和α-变形菌的数量。经SY治疗后，生态失调得到改善（图6B）。这些结果表明SY调节了DEN诱导的肝癌小鼠的肠道微生物群。使用差异丰度分析确定SY治疗相关细菌。SY处理显著降低了许多属的丰度，尤其是巴恩斯氏菌和Ersipelotrichae incertae sedis（图6C）。热图（图6D）总结了三组中细菌在属水平上的差异（图6D）。   图6. 红花黄色素（SY）治疗N-亚硝基二乙胺（DEN）诱导的肝细胞癌（HCC）小鼠后肠道微生物群的变化。（A）Venn图中所示群体肠道微生物群中独特且共享的操作分类单元。（B）类水平绝对丰度分布图。（C）不同的细菌在门的水平。（D）三个类群在属水平上差异最大的类群的热图。两组之间的平均值存在显著差异：与对照组相比，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著。

讨论

红花 (Carthamus tinctorius L.) 是一种具有多功能应用的中药，现代药理研究表明，SY是红花的主要活性成分。SY已用于心脑血管疾病的治疗。在本研究中，我们发现SY单独或与CTX联合使用可降低DEN诱导的肝癌小鼠模型的肝损伤，并抑制肝脏中炎症因子的释放。此外，SY通过影响胶原沉积的表达，增加CD8+T细胞和Gr-1+巨噬细胞的浸润，从而改善免疫微环境。进一步的细胞实验表明SY通过TGF-β/Smad信号通路降解肝细胞中的胶原。我们还发现SY调节肠道微生物群，在免疫微环境中发挥重要作用。总之，这些发现表明，抑制炎症反应、促进胶原降解和调节肠道微生物群以改善免疫微环境可能是SY抑制HCC发展的主要途径（图7）。

肝癌的特点是免疫微环境发生改变，因为患者通常患有慢性肝脏炎症。临床研究表明，肝癌的免疫细胞组成与预后和化疗反应有关。免疫细胞，如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、，肿瘤的CD8+T细胞浸润被认为是提高癌症患者生存率的一个指标。我们的研究表明SY可以促进DEN诱导的肝癌中CD8+T细胞的浸润。肝巨噬细胞在慢性肝损伤的发病机制中起着核心作用，是对抗纤维化的潜在靶点。然而，由于巨噬细胞的异质性，肝巨噬细胞通过促进或降解细胞外基质的过度沉积在肝纤维化中发挥双重功能。据报道，F4/80+CD11b+Gr-1+巨噬细胞通过产生TGF-β促进肿瘤的发展，一种抑制肿瘤免疫监视的细胞因子。在本研究中，DEN诱导肝脏中F4/80+CD11b+Gr-1+巨噬细胞大量增加，这可能促进细胞外基质沉积和肝纤维化。用SY或联合CTX治疗后，F4/80+CD11b+Gr-1+巨噬细胞的百分比下降，尤其是联合治疗后。由于SY还抑制肝细胞中TGF-β的表达，我们怀疑SY降低了F4/80+CD11b+Gr-1+巨噬细胞降解肝脏胶原的百分比。小鼠骨髓间充质干细胞，定义为F480−CD11b+Gr-1+髓样细胞已经被报道可抑制T细胞增殖，并导致多种癌症（包括HCC）中免疫抑制功能的形成。我们的研究还表明，SY降低了肝脏中MDSCs的百分比，与CD8+T细胞百分比的增加平行。因此，据我们所知，本研究首次为SY通过影响肝脏免疫细胞成分改善免疫微环境提供实验支持。

新证据表明肠道微生物群调节免疫反应；因此，微生物群是许多类型癌症（包括HCC）肿瘤微环境的重要组成部分。为支持我们的研究结果，DEN治疗组的16SrRNA分析显示拟杆菌富集，据报道，拟杆菌与几种全身炎症和免疫标记物相关。使用SY治疗后，拟杆菌丰度显著降低，提示SY通过炎症缓解、肝损伤和促肿瘤刺激在HCC进展中发挥作用。此外，与模型组相比，SY治疗组中的许多微生物群，如Alloprovotella、巴恩斯氏菌和瘤胃球菌，显示出较低的丰度；据报道，这些微生物群是有效的炎症调节因子。总之，我们的数据表明，SY的存在可以调节炎症相关的肠道微生物群的丰度，这表明SY可能调节肿瘤免疫微环境。

总之，我们的研究提供了强有力的证据，证明SY在DEN诱导的HCC模型中抑制肝脏炎症并促进胶原降解。此外，SY和CTX联合使用可增加CD8+T细胞和Gr-1+巨噬细胞对肝脏的浸润。因此，SY显著改善了肿瘤免疫微环境和肠道微生物群。SY联合CTX在抑制DEN诱导的肝癌小鼠肝肿瘤发生率和延长生存期方面显示出更好的治疗效果。虽然我们的研究显示了很高的临床前意义，但是在HCC患者的临床试验中尚未评估SY和CTX的作用。然而，SY促进细胞外基质的降解并修饰肠道微生物群以改善小鼠的免疫抑制，这可能为预防和治疗HCC提供有效的策略。

图7 红花黄色素（SY）在N-亚硝基二乙胺（DEN）诱导的肝细胞癌（HCC）中的调节机制示意图。DEN治疗引起肝脏炎症，随后是胶原沉积，导致免疫抑制。此外，肠道微生物群失调促进免疫抑制。所有这些过程都有助于肝癌的发展。SY通过调节DEN诱导的TNF-α和NF-κB抑制炎症，并通过TGF-β/Smad信号通路降解胶原，促进CD8+T细胞和Gr-1+巨噬细胞浸润；通过增加肠道微生物群调节，SY抑制DEN诱导的HCC。