季节显著的影响了林麝和高山麝肠道菌群结构和功能（国人佳作）

编译：微科盟北岸，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

由于过度捕猎和栖息地破碎，麝已成为全球濒危物种。圈养麝可以有效地缓解麝的捕猎压力，有利于野生麝种群的保护和麝的供应。然而，其对麝肠道菌群的影响尚不清楚。近年来的研究表明，肠道微生物群与宿主的健康及其对环境的适应有关，并受到多种因素的影响。对262份森林麝（Moschus berezovskii；FMD）粪便样本和90份高山麝（M. chrysogaster；AMD）粪便样本采用高通量测序技术进行16S rRNA基因测序。季节变化是否会影响麝香鹿肠道菌群的结构和功能？结果表明，FMD和AMD在寒冷季节的肠道菌群α多样性高于温暖季节，表明季节变化会影响麝的肠道菌群多样性。PCoA也显示AMD和FMD肠道菌群的结构和功能存在显著的季节性差异。厚壁菌门和拟杆菌门是AMD和FMD的优势菌门。厚壁菌门的相对丰度和厚壁菌门与拟杆菌门的比值在夏季显著低于春季，在冬季显著高于夏季。拟杆菌门的相对丰度则相反。此外，麝肠道菌群的优势菌属和主要代谢功能也存在显著的季节差异。总体而言，FMD主要肠道菌群代谢功能丰度在寒冷季节显著升高。WGCNA分析表明，OTU6606、OTU5027、OTU7522和OTU3787处于网络的核心，且与季节变化显著相关。这些结果表明，圈养麝肠道菌群的结构和功能随季节变化，有利于环境适应和食物的消化代谢。这项研究为麝的健康圈养繁殖和未来的野生种群恢复计划提供了有价值的见解。

论文ID

原名：Marked Seasonal Variation in Structure and Function of Gut Microbiota in Forest and Alpine Musk Deer

译名：季节显著的影响了林麝和高山麝肠道菌群结构和功能

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：5.640

发表时间：2021.9.6

通讯作者：张同作

通讯作者单位：中国科学院西北高原生物研究所高原生物适应与进化重点实验室；青海省动物生态基因组学重点实验室

DOI号：10.3389/fmicb.2021.699797

实验设计

实验结果

1 序列数据评估

本研究分别获得了36,862,468（140,696 reads/样本）和12,912,306（143,470 reads/样本）条高质量的clean reads。随着测序深度的增加，sobs和Shannon指数在OTU水平上的稀疏曲线逐渐平缓（附图1）。结果表明，每个粪便样本都有足够的OTUs来反映细菌多样性的最大水平，表明测序深度满足后续分析。

在FMD和AMD中分别注释到3548和2259个OTUs。在97%的序列一致性阈值下，FMD的OTUs被分为20个菌门，35个菌纲，93个菌目，171个菌科和404个菌属；AMD被分为17个菌门，27个菌纲，66个菌目，125个菌科和300个菌属。

2 不同季节AMD和FMD肠道菌群的组成

测序分析表明厚壁菌门（71.35 ± 12.19%）和拟杆菌门（24.89 ± 12.04%）在不同季节不同年龄的圈养FMD中是优势菌门（图1A）。除此之外，放线菌门（1.20%）和变形菌门（1.02%）也为优势菌门（相对丰度>1%）。以可鉴定的菌属为基础，利用相对丰度排名前30位的菌属进行热图分析，其中，Christensenellaceae R7 group（13.64%）、UCG 005（10.44%）和Bacteroides（8.46%）高于5%。Rikenellaceae RC9 group（4.25%）、Alistipes（3.33%）、Ruminococcus（2.35%）、Prevotellaceae UCG-004（2.22%）、Monoglobus（1.74%）和NK4A214 group（1.56%）也为优势菌属（> 1%）（图1C）。在冬季、早春和秋季，幼崽和成体聚为一种类型，而夏季和晚春聚为另一种类型。FMD的优势菌属属于厚壁菌门或拟杆菌门。不同季节、不同年龄的10组FMD粪便样本共享18个菌门和233个细菌属，仅有少数独特菌门和菌属（图1E）。

与之相似，厚壁菌门（60.22 ± 10.04%）和拟杆菌门（36.58 ± 10.26%）在90份不同季节、不同年龄的圈养AMD粪便标本中也为优势菌门（图1B）。Bacteroides（14.47%）、UCG 005（11.75%）、Rikenellaceae RC9 gut group（8.12%）和Christensenellaceae R7 group（8.11%）的相对丰度均高于5%。Alistipes（4.20%）、Prevotellaceae UCG-004（1.59%）、Anaerostipes（1.55%）、Ruminococcus（1.52%）和Candidatus Stoquefichus（1.17%）的相对丰度高于1%（图1D）。AMD的优势菌属也属于厚壁菌门或拟杆菌门。两季、不同年龄的6组AMD粪便样本共享13个菌门和221个菌属，没有独特的菌门或菌属（图1F）。

图1 FMD和AMD肠道菌群组成。FMD（A）和AMD（B）的单个菌门相对丰度直方图。FMD（A）和AMD（B）优势菌门的相对丰度。基于可鉴定菌属的热图分析，FMD（C）和AMD（D）的相对丰度为top30的菌属热图。红色、蓝色、浅绿色、黑色和深绿色的字母分别代表厚壁菌门、拟杆菌门、Planctomycetes、变形菌门和Spirochaetes。在门和属分类水平上分析FMD （E）和AMD （F）的核心细菌和独特细菌。基于Sobs指数（G）和Shannon指数（H）的麝肠道微生物区系α多样性的季节变化。

3 肠道菌群季节差异分析 3.1 α多样性的季节变化

不同季节圈养FMD和AMD的Good’s Coverage指数均高于99%。采用sobs指数和Shannon指数来反映不同季节麝肠道菌群的多样性。圈养FMD幼崽肠道菌群α多样性在早春显著低于其他时期（p < 0.05），冬季显著高于其他季节（图1G和H）。成体α多样性冬季显著高于其他时期（p < 0.05），夏季显著低于其他时期（p < 0.05）。总体来看，冬季和秋季圈养FMD肠道菌群α多样性高于春季和夏季。圈养AMD成体的肠道菌群α多样性冬季显著高于晚春（图1G和H；p < 0.05）。此外，幼崽和老龄AMD的冬季肠道菌群α多样性高，但不显著。

3.2 β多样性季间的变化

采用Bray-Curtis距离算法计算圈养麝不同季节粪便样本间的距离。采用ANOSIM分析，检验不同季节组间差异是否显著大于组内差异。PCoA分析显示R值均大于0（p = 0.001）。不同季节FMD肠道微生物组成存在显著的季节差异，组间差异显著大于组内差异（图2A和C）。夏季组和冬季组（R = 0.3078, p = 0.0010）、秋季组和冬季组（R = 0.3254, p = 0.001）差异均比较显著。圈养AMD成体的肠道微生物组成在冬季和晚春之间存在显著差异（R = 0.1332, p = 0.016）。此外，组间差异显著大于组内差异（图2D和E）。

图2 不同季节麝肠道微生物组成PCoA分析。幼崽FMD（A）与成体FMD（B）5个不同时期主坐标图。（C）FMD每两季间肠道菌群的ANOSIM分析。晚春和冬季组的幼崽（D）、成体（E）和老龄（F）AMD的PCoA分析。

4 优势菌群的季节差异分析

采用Wilcoxon秩和检验分析季节间的显著差异。对于FMD的幼崽和成体，厚壁菌门的相对丰度在冬季显著高于其他时期（p < 0.05，图3A），拟杆菌门则相反（p < 0.05，图3B）。夏季厚壁菌门的相对丰度低于其他时期，拟杆菌门的相对丰度则相反。总体而言，FMD中厚壁菌门的相对丰度在秋季、冬季和早春高于晚春和夏季。相比之下，拟杆菌门的结果正好相反（图3A和B）。对于不同年龄的圈养AMD，冬季厚壁菌门的相对丰度高于晚春，拟杆菌门的相对丰度则相反。特别是成体AMD有显著的季节差异（p < 0.05）。

厚壁菌门与拟杆菌门的比值分析（F/B）显示，幼崽和成体的F/B比值在冬季均显著高于其他时期（p < 0.05；图3C和D）。总体上，F/B比值在夏季显著低于春季，冬季显著高于夏季。同样，不同年龄圈养AMD的F/B比值在冬季高于晚春，成年AMD之间存在显著的季节差异（p < 0.05；图3E）。

季节差异分析表明，幼崽和成体FMD的9个优势菌属具有显著的季节差异。在冬季和早春，Christensenellaceae R7 group和Ruminococcus的相对丰度显著高于其他时期。夏季，UCG-005和Monoglobus的相对丰度显著高于其他时期。Alistipes的相对丰度在春末和夏季显著高于其他时期（图3F和G）。在AMD的9个优势菌属中，Bacteroides、UCG-005、Alistipes和Anaerostipes具有明显的季节差异。冬季，UCG-005和Alistipes的相对丰度显著高于晚春，Bacteroides和Anaerostipes的相对丰度则相反（图3H）。

图3 圈养FMD和AMD优势菌群的季节差异分析。FMD和AMD的厚壁菌门（A）和拟杆菌门（B）季节差异分析。FMD幼崽（C）、成体（D）和AMD不同年龄段（E）F/B比值的季节差异分析（排除极端值）。不同年龄AMD（H）、FMD幼体（F）、FMD成体（G）优势菌群的季节差异分析。∗p < 0.05 (Wilcoxon 秩和检验)，∗∗p< 0.01和∗∗∗p < 0.001。ns， 没有显著性差异。

5 功能预测分析 KEGG数据库功能预测分析显示，圈养FMD和AMD的肠道菌群主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、辅助因子和维生素代谢、翻译、复制和修复。EggNOG数据库显示有17个功能相对丰度较高。KEGG数据库显示，圈养FMD的4种主要代谢相关功能存在季节差异。总体而言，各功能在夏季显著低于其他季节（p < 0.05），春季相对高于其他季节（图4A）。圈养AMD的主要代谢相关功能在晚春高于冬季。能量代谢功能也存在显著的季节差异（p < 0.05；图4C）。 EggNOG数据库显示，6种主要代谢相关功能也存在季节性差异。总体而言，春季的功能相对高于其他季节。除脂质转移和代谢功能外，夏季圈养FMD肠道菌群的主要代谢功能均显著低于其他季节（p < 0.05；图4B）。同样，圈养AMD除氨基酸转移和代谢功能外，其余主要代谢功能均在晚春高于冬季（图4D）。

图4 基于KEGG和EggNOG数据库的肠道微生物功能预测及季节差异分析。基于KEGG数据库（A）和EggNOG数据库（B）的FMD肠道菌群主要功能的季节差异分析。基于EggNOG数据库（C）和KEGG数据库（D）的AMD肠道菌群主要功能的季节差异分析。∗p < 0.05 (Wilcoxon 秩和检验)，∗∗p < 0.01和∗∗∗p < 0.001。ns， 没有显著性差异。

6 使用WGCNA分析，核心OTUs随季节波动

加权相关网络分析中参与者的基线特征。研究共包括262只FMD和3493个OTUs，平均年龄和雄性比例分别约为2.45岁和75.19%。早春（T1）、晚春（T2）、夏（T3）、秋（T4）和冬（T5）季的个体分别占18.70%、21.76%、21.37%、19.08和19.08%；样本树状图和性状热图如附图4所示。相关分析构建采用一步网络构建。

设置网络类型为signed，运行阈值为8，根据近似无标度拓扑准则定义邻接矩阵（附图5），最小模块尺寸为30，模块检测灵敏度DeepSplit设置为3，切割高度为0.25的模块合并，即特征基因在0.75以上相关的模块将被合并（附图6）共3493个OTUs被解析为13个不同的颜色模块。在这13个模块中，灰色模块表示未分配的细菌类群。在树状图中，每一枝以一条短的垂直线表示，对应于一个细菌分类单元。树状图组紧密相连的分支代表高度共生的细菌分类群（附图7）。

研究人员计算了模块特征值与特征值之间的相关性。模块-性状关系热图显示了模块特征值与性状之间的相关系数（−1 - 1）。黑色模组与5个不同季节具有显著相关（p < 0.01），与其他性状（年龄、性别）无相关性（图5A）。因此，选择黑色模块进行后续分析。

此外，提取了WGCNA中重要性前10%的OUT（Ktotal（网络连通性）值占前10%），并在Cytoscape中构建了网络图（715个节点和9447条连接线）。结果表明，黑色模组相对独立，与其他模组相关性较低（图5B）。黑色模块与季节变化相关性最高，核心OTU中有14个OTUs位于黑色模块中，与季节变化相关性显著（图5C）。提取黑色模块中连通权重值大于0.02的OTUs，构建黑色模块的网络图（图5D）。灰色线的粗细程度代表OTU间共现强度。OTU节点的大小表示Kwithin值（模块内连通性）以及节点与黑色模块之间的连通性。CytoHubba插件进一步用于提取核心OTUs，包括OTU6606、OTU5027、OTU7522和OTU3787（图5E），作为前4名，它们属于厚壁菌门中的Oscillospirales菌目，前三个核心OTUs属于Oscillospiraceae菌科UCG-005菌属。

图5 基于WGCNA的关键模块和核心OTUs识别。（A）麝的模特征值与性状的相关性。颜色深度对应于括号中各模块的相关深度和p值。（B）核心OTUs网络分析图。每个节点代表Ktotal值在前10%的OTUs，其颜色代表对应的模块。灰线粗细表示节点之间的权重值。（C）黑色模块中核心 OTUs的可视化。（D）与不同季节相关的黑色模块的全加权网络可视化。节点大小表示黑色模块中节点的Kwithin值，即模块内连接的大小。灰线厚度表示节点间（OTUs）的权重值。（E）通过Cytohubba识别黑色模块中的关键OTUs。节点大小表示Kwithin值，红色阴影表示模块内的重要性。

讨论

正常稳定状态的肠道菌群与宿主的健康密切相关，通过复杂的相互作用与宿主共同进化，形成互惠关系，其独特的群落结构和代谢产物对调节寄主的代谢、生长发育、抗病原体、免疫调节、适应和进化等都是必不可少的。此研究系统、全面地分析了不同年龄圈养FMD和AMD肠道菌群的季节性差异。结果表明，FMD和AMD共有7个优势菌属，包括Bacteroides、Christensenellaceae R7 group、UCG 005、Rikenellaceae RC9 gut group、Alistipes、Ruminococcus、Prevotellaceae UCG 004 （FMD）和 Christensenellaceae R7 group、Ruminococcus和Prevotellaceae UCG 004（AMD）。目前的研究表明，Christensenellaceae R7 group广泛存在于宿主的肠道和粘膜中，是机体健康所必需的，参与氨基酸和脂类代谢。Ruminococcus参与反刍动物瘤胃中纤维素和半纤维素的降解。它产生几种纤维素酶和半纤维素酶，将膳食纤维转化为各种营养物质。它还参与反刍动物的食物消化和碳水化合物代谢。Prevotellaceae UCG 004参与多糖的降解和短链脂肪酸（SCFAs）的生产。Christensenellaceae菌科（Christensenellaceae R7 group属于该科）、Ruminocococace（Ruminocococus属于该科）和Alistipes属与免疫调节和健康稳态相关，被认为是潜在的有益细菌。其中Christensenellaceae R7 group和Alistipes被归类为肠道疾病（克罗恩病、结直肠癌、艰难梭菌感染等）的潜在生物标志物。此外，Bacteroides、Alistipes和Rikenellaceae RC9 gut group均属于拟杆菌门。Bacteroides可以改善宿主的代谢，主要通过参与胆汁酸、蛋白质和脂肪的代谢，调节碳水化合物的代谢。Alistipes参与SCFAs的代谢。Bacteroides和Alistipes属耐胆微生物。高脂肪动物饲料可增加Bacteroides和Alistipes的相对丰度，从而通过调节乙酸的产生改善脂质代谢。Rikenellaceae RC9 gut group也促进脂质代谢。

不同季节圈养麝352份粪便样本中，厚壁菌门和拟杆菌门占显著优势（相对丰度超过90%），与其他研究一致。厚壁菌门和拟杆菌门是反刍动物瘤胃的优势核心细菌，相对丰度最高。它们参与了食物消化、营养调节和吸收、能量代谢以及宿主胃肠道抵御外来病原体入侵等重要过程。厚壁菌门促进食物中的纤维降解，将纤维素转化为挥发性脂肪酸，促进食物消化和生长发育。其中，FMD和AMD肠道菌群前30个菌属中，厚壁菌门分别为23和19个。大部分与碳水化合物代谢和纤维素消化吸收有关。拟杆菌门主要促进食物中蛋白质和碳水化合物的消化吸收，从而促进胃肠道免疫系统的发育。在FMD和AMD鉴定的前30个菌属中，分别有5个和8个拟杆菌门，其中大多数参与脂质代谢。饲料的营养水平直接影响厚壁菌门和拟杆菌门的丰度。因此，在不同季节和年龄的FMD和AMD中，厚壁菌门和拟杆菌门是核心优势菌群。此外，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度及其比例具有显著的季节差异。寒冷季节厚壁菌门相对丰度和F/B比均高于温暖季节。这有利于圈养FMD和AMD适应寒冷季节，从而促进饲料中纤维素和半纤维素的分解，碳水化合物的代谢和营养物质的消化吸收。

FMD和AMD是典型的反刍动物。野生个体以各种高纤维叶子为食，而圈养个体以精饲料和粗饲料为食。前者主要包括胡萝卜、马铃薯、玉米、大豆等，后者包括鲜叶（温暖季节）或干叶 (寒冷季节)。核心菌属和优势菌属在圈养FMD和AMD的食物消化、养分吸收和能量代谢中起着至关重要的作用。在此，寒冷季节的Christensenellaceae R7 group、Ruminococcus和Prevotellaceae UCG 004（厚壁菌门）的相对丰度高于温暖季节。Bacteroides（拟杆菌门）的相对丰度则相反，表明优势菌属的季节差异与不同时期动物饲料组成密切相关。

PCoA表明，成年麝和幼年麝均存在显著的季节差异，说明不同季节的FMD和AMD的肠道微生物结构和组成存在显著差异，与其他研究一致。季节差异与食物资源、膳食结构、营养物质利用和饲养模式密切相关。Wilcoxon秩和检验表明，圈养FMD和AMD肠道菌群α多样性具有显著的季节差异。总体来看，冬秋季麝肠道菌群α多样性高于春夏季。以往的研究表明，α多样性越高，肠道菌群组成越复杂、稳定，增强了对外界干扰的抵抗力和适应性，有利于宿主健康。α多样性的减少或丧失与多种疾病相关。因此，已报道的圈养FMD和AMD肠道菌群α-多样性在秋冬季较高，可以提高对不利环境因素的抵抗力，减少不利环境因素的影响，促进高纤维食物的摄入和营养物质在寒冷季节的吸收利用。

基于KEGG和EggNOG数据库显示，圈养FMD和AMD的肠道微生物主要涉及碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢。这些代谢功能也存在季节差异，并与核心菌门和菌属显著相关。核心细菌丰度的季节变化也与菌群功能变化密切相关。季节变化对麝肠道菌群的影响高于年龄和性别。WGCNA分析表明，黑色模组与其他模组相关性较低，与季节相关性最高。OTU6606、OTU5027、OTU7522和OTU3787随季节波动显著，均属于厚壁菌门。4个核心 OTUs处于黑色模块的核心位置，对黑色模块共生菌群网络结构影响较大，可作为评价圈养林麝肠道健康的重要指标。

结论

本研究通过对352份圈养FMD和AMD（不同年龄）的粪便样本进行16S rRNA基因测序，系统全面分析了肠道微生物结构和功能的季节差异。比较分析发现，α多样性、核心微生物群和代谢功能具有显著的季节变化。两种麝肠道微生物群的α多样性、厚壁菌门相对丰度和F/B比值在寒冷季节高于温暖季节。FMD的主要代谢相关功能在寒冷季节也显著高于温暖季节。确定的4个核心OTUs可作为评价圈养林麝肠道健康的重要指标。因此，这项研究为圈养繁殖环境和未来的再引种计划提供了见解。此外，通过对肠道菌群的功能注释分析和代谢途径的季节变化，结合宏基因组和代谢组学分析，有助于未来进一步探讨肠道菌群在FMD和AMD的健康、环境适应和代谢方面的作用。