口服纳米复合物可调节肠道微生物群并减轻阿尔茨海默病样发病机制

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

阿尔茨海默病（AD）是一种与淀粉样β（Aβ）沉积相关的神经退行性疾病，导致神经毒性（氧化应激和神经炎症）和肠道微生物群失衡。白藜芦醇（Resveratrol，Res）具有神经保护作用，但其体内生物利用度很低。在此，我们开发了一种小型Res硒肽纳米复合物，使Res能够应用于消除氯化铝（AlCl3）和D-半乳糖（D-gal）诱导的AD模型小鼠中Aβ聚集诱导的神经毒性和减轻肠道微生物群紊乱。稀土功能性硒纳米颗粒(Res@SeNPs)首先制备（8±0.34 nm），然后制备Res@SeNPs用血-脑屏障转运肽（TGN肽）修饰以生成Res-硒肽纳米复合物（TGN）-Res@SeNPs)（14±0.12 nm）。口服TGN-Res@SeNPs通过（1）与Aβ相互作用，减少Aβ聚集，有效抑制海马内Aβ沉积，改善认知障碍；（2） 降低Aβ诱导的活性氧（ROS），提高PC12细胞和体内抗氧化酶活性；（3） 通过核因子-κB/丝裂原活化蛋白激酶/Akt信号通路下调BV-2细胞和体内Aβ诱导的神经炎症；和（4）缓解肠道微生物群紊乱，特别是氧化应激和炎症相关细菌，如Alistipes、幽门螺杆菌、理研菌、脱硫弧菌和粪杆菌。因此，我们预计Res-硒肽纳米复合物将为AD的治疗提供一种新的潜在策略。

论文ID

原名：Oral Administration of Resveratrol-Selenium-Peptide Nanocomposites Alleviates Alzheimer’s Disease-like Pathogenesis by Inhibiting Aβ Aggregation and Regulating Gut Microbiota 

译名：白藜芦醇-硒-肽纳米复合材料的口服给药通过抑制Aβ聚集和调节肠道微生物群来减轻阿尔茨海默病样发病机制

期刊：ACS Applied Materials & Interfaces

IF：9.229

发表时间：2021年9月27日

通讯作者：郑国栋和杨丽聪

通讯作者单位：江西农业大学食品科学与工程学院天然产品与功能食品重点实验室；福州大学生物科学与工程学院

DOI号：10.1021/acsami.1c14818 

实验设计

结果

1 TGN-Res@SeNPs的制备

如方案1所示，制备了具有小尺寸和简单逐层结构的多功能硒纳米颗粒。用高分辨率透射电镜观察了纳米粒子的形貌。如图1A、B所示，Res@SeNPs呈现出均匀、近球形结构，具有良好的分散性和较小的尺寸。使用Nano-ZS纳米粒度分析仪测定，Res@SeNPs的平均粒径为8±0.34 nm，zeta电位为−10.31±1.17 mV（表S1，支持信息）。在使用静电力施加TGN肽后，纳米颗粒的形状保持不变（图1C，D）。然而，TGN-Res@SeNPs的平均直径增加至14±0.12 nm，zeta电位增加至−6.01±0.39 mV（表S1，支持信息）。能量色散X射线光谱（EDX）表明纳米颗粒的元素组成包括硒（图1E，F）在EDX图中也很容易检测到属于Res和TGN肽的C、N和O元素。特别是，N原子占Res@SeNPs总原子数的5.30%，该值在TGN-Res@SeNPs中增加到28.00%，证实TGN-Res@SeNPs中存在TGN肽。

图1G显示Res显示出发射波长为397 nm的荧光。在SeNPs上修饰Res和TGN肽后，荧光强度逐渐降低。这一结果与我们之前的研究结果一致。根据紫外-可见吸收光谱（图1H），C=C和苯在Res中的特征吸收峰分别位于305和215 nm处。用Res对SeNPs进行修饰后，这些吸收峰位移到304和214 nm。最后，用TGN肽修饰Res@SeNPs后，吸收峰进一步移到303和210 nm。这一结果证实了改性纳米颗粒上Res和TGN的存在。

通过FTIR分析官能团，以确定Res、TGN肽和SENP之间的联系（图1I）。3287.70 cm–1处的峰值对应于O–H的拉伸振动，而1595.73 cm–1处的峰值则归因于Res中的 C=C拉伸振动。在Res@SeNPs光谱中，上述特征峰移至3303.94和1654.56 cm-1，表明Res通过−OH基团形成O-Se键与SeNPs结合。C═O拉伸吸振峰位于1663.16cm-1处，而在1523.80和1456.40cm-1处的峰代表TGN肽中酰胺键的拉伸吸振峰。经过修饰后，这些峰分别移至1651.68、1553.33和1435.96cm-1。这些结果证实了Res和TGN肽被成功地涂覆在纳米颗粒表面。我们使用高效液相色谱和BCA试剂盒对TGN-Res@SeNPs中Res和TGN肽的浓度进行定量，Res和TGN肽的吸附效率分别达到50.42和82.04%（数据未显示）。

长期稳定性是纳米颗粒体内应用的关键因素。如图1J所示，细胞培养基中的纳米颗粒尺寸在70 h内保持非常稳定。胃肠道（GI）是人体的主要屏障之一。因此，我们还研究了纳米颗粒在胃肠道条件下的结构和功能，包括pH值和消化酶。通常，黄酮类化合物在碱性溶液中不稳定，而人体小肠处于碱性环境。Res在碱性条件下不稳定。在pH值为8时，Res保持在74%的水平，在pH值为10时，Res保持在45%的水平，而纳米颗粒中的Res值超过了80%（图S1A，支持信息）。同时，Res在胃消化条件下非常稳定，但在肠消化条件下观察到Res的分解（图S1B，支持信息）。在肠道消化4小时后，Res保持在49%的水平，通过DPPH清除率评估的抗氧化活性也降低（图S1C、D，支持信息）。在胃和肠道消化条件下，Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的DPPH清除率是稳定的(图S1C，D，支持信息)。口服后小肠内Res的分解可能是其生物利用度差的主要原因。

方案1. TGN-Res@SeNPs的合成示意图

图1. 纳米颗粒的表征。（A、B）Res@SeNPs的高分辨率透射电镜图像。(C，D)TGN-Res@SeNPs的高分辨率透射电镜图像。（E）Res@SeNPs的元素组成分析。（F）TGN-Res@SeNPs的元素组成分析。（G）Res、Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的荧光光谱。（H）Res、Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的紫外-可见吸收光谱。（I）TGN-Res@SeNPs(a)、Res@SeNPs（b）、Res（c）和TGN（d）的FTIR光谱。(H)细胞培养基中Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的稳定性。

2 多功能硒纳米颗粒改善AlCl3和D-半乳糖诱导的AD小鼠的记忆损伤

在我们的研究中，用AlCl3和D-gal处理的ICR小鼠作为AD模型（图2A）。与AD模型相比，对照组、Res、Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs组的体重较高（图2B），但Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs组的食物/能量摄入没有明显增加(图S2A，支持信息)。这一结果表明Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs有助于AD小鼠在不改变其总能量摄入的情况下保持正常体重。首先使用MWM测试评估小鼠的空间学习和记忆能力。如图2C，D所示，与对照组相比，AD模型小鼠在学习表现方面表现出明显的记忆缺陷，表现为逃避潜伏期延长和游泳距离增加，以便在5天的导航测试中找到目标象限。Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs在5天的导航测试中，逃逸潜伏期和距离缩短，表明TGN-Res@SeNPs可以改善认知缺陷。在探针试验日，TGN-Res@SeNPs处理显著增加了通过平台的次数，减少了逃逸潜伏期，反映了AD模型小鼠空间记忆的改善 (图2E-G)。AD模型小鼠的脑室面积明显减少，但Res和纳米颗粒改善了这一区域 (图S2B，支持信息)，进一步表明纳米颗粒缓解了AD模型中的记忆缺陷和脑萎缩。此外，TGN-Res@SeNPs在消除认知障碍方面表现出更强于Res@SeNPs和Res的效果。

图2. TGN-Res@SeNPs可减轻AD模型小鼠的认知障碍。（A）描述每组实验处理的时间线。（B）体重。采用MWM检验评价小鼠的认知功能和空间记忆。在5天的训练中，逃生延迟（C）和到隐藏平台的游泳距离（D）。第6天通过平台（E）、通过平台的次数、逃逸潜伏期(F)和测试的代表性轨迹（G）。每组n=10只小鼠；数据以平均±标准差表示，用方差确定统计学意义。字母a-d表示不同组间的显著性差异（p<0.05）。

3 多功能硒纳米颗粒降低AlCl3和D-半乳糖诱导的AD小鼠的Aβ聚集

Aβ斑块和神经元丢失是AD的关键标志物。通过H&E染色观察海马神经元细胞形态的变化（图3A）。与对照组正常神经元形态不同，在AD模型中观察到包括神经元收缩和核细胞膜边界在内的异常形态。病理检测显示，与Res相比，TGN-Res@SeNPs和Res@SeNPs减少了神经元完整性的损伤和更少的形态学变化。AD的病理也与神经递质的异常功能相关，包括γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（谷氨酸）、乙酰胆碱（Ach）、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)和天冬氨酸(Asp)。GABA是一种抑制性神经递质，参与维持大脑刺激的平衡，抑制认知功能中的神经传导。谷氨酸是兴奋性氨基酸神经递质之一，在神经系统中兴奋性信息的传递中发挥着重要作用。研究表明，AD中GABA含量降低，Glu水平升高。根据AD的胆碱能理论，Ach的浓度降低，导致患者的记忆受损。此外，学习和记忆也与单胺类神经递质密切相关，如多巴胺（DA）、NE和5-HT。酪氨酸是单胺类神经递质的前体，包括NE和DA。色氨酸是一种必需的氨基酸，参与血清素的合成。据报道，AD中胆碱能、伽马氨基丁酸能、5-羟色胺能、谷氨酸能和多巴胺能神经元受到干扰。在本研究中，大脑中7种神经递质的浓度发生了显著变化(图3B)。与之前的研究一致，AD模型小鼠的兴奋性氨基酸（Glu）水平显著升高，而抑制性氨基酸 (GABA) 和相关神经递质（Ach、NE、His、Tyr和Tr）水平显著降低。经TGN-Res@SeNPs治疗后，这7种神经活性物质的海马水平恢复到正常水平。这一发现表明，TGN-Res@SeNPs可能通过调节大脑中神经活性物质的水平来保护中枢神经系统的功能，从而提高AD小鼠的学习记忆能力。

免疫染色分析显示，外源性给予氯化铝和D-gal显著增加海马Aβ斑块（图3C）。在Res和Res@SeNPs存在时，Aβ聚集物略有减少，但TGN-Res@SeNPs明显减少。这些结果表明，氯化铝联合D-gal成功地诱导了ICR小鼠大脑中AD相关的病理改变，而TGN-Res@SeNPs抑制了这些AD模型小鼠中Aβ的聚集。在AD中，记忆丧失与从可溶性Aβ单体向高有序蛋白纤维聚集物的转移有关。在我们之前的研究中，我们证明了100nm Res@SeNPs可以与Aβ单体结合并停止聚集过程。然而，小尺寸的Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs是否也能结合Aβ单体并抑制聚集尚不清楚。在这种情况下，首先通过RLS分析了纳米颗粒与Aβ42之间的相互作用。在SeNPs波长范围内，Res@SeNPs在200-800nm范围内以剂量依赖的方式表现出强的RLS信号（图S3A，B，支持信息）。当Aβ42单体暴露于Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs时，Aβ42单体结合到Res@SeNPs或TGN-Res@SeNPs上，导致散点大小增加，RLS强度增强（图3D，E）。

其次，利用ThT监测Aβ单体的体外聚集过程。在AD中，高浓度的氧化还原活性Cu2+可以与Aβ结合，促进Aβ聚集，并产生神经毒性ROS。因此，一个典型的Aβ聚集的体外模型使用了Cu2+与Aβ42单体孵育。ThT荧光强度与Aβ聚集水平有关。如图3F所示，Aβ42自发聚集，荧光在趋于稳定前逐渐增加。与Cu2+孵育后，Aβ42聚集物的荧光强度迅速增加。在Res存在的情况下，ThT荧光强度有轻微的变化，而在使用Res@SeNPs或TGN-Res@SeNPs时，荧光强度则以剂量依赖的方式明显降低（图S3C-E，支持信息）。通过透射电镜观察到Aβ聚集体物的形态（图3G）。孵育3天后，Aβ42单体形成了明确的原纤维结构。同时，在Cu2+存在的存在下形成了一个大的斑块。Res@SeNPs或TGN-Res@SeNPs显著降低了Cu2+诱导的Aβ42聚集，只观察到少量的纤维。透射电镜分析进一步证实了纳米颗粒对ThT荧光法检测到的组装Aβ42聚集物超微结构变化的抑制作用。

血脑屏障是一种天然的防御系统，它可以保护大脑免受有害物质的伤害，并阻止大多数Aβ抑制剂到达大脑。为了模拟体内的血脑屏障，bEnd.3 细胞（小鼠脑内皮细胞系）和PC12细胞（神经元细胞系）在迁移实验板中共培养（图3H）。以Res荧光作为探针，测量Res和纳米颗粒渗透血脑屏障的能力。正如预期的那样，在bEned.3和PC12细胞中几乎没有检测到Res荧光信号（图3I），并且Res的转运效率仅为4%（图3J）。Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的屏障传输效率高于Res。TGN-Res@SeNPs能够通过血脑屏障的运输效率约为75%，而Res@SeNPs的传输效率为12%（图3J）。ICP–MS用于测定SeNPs在体内的血脑屏障转运能力。与我们的体外血脑屏障模型的结果一致，TGN-Res@SeNPs的浓度远高于Res@SeNPs的浓度（图3K）。以往的研究发现，TGN修饰的纳米颗粒可以明显提高未修饰的纳米颗粒的运输可用性。由于血脑屏障的高渗透性，TGN-Res@SeNPs在减少体内Aβ沉积方面比Res@SeNPs更有效。

 图3. TGN-Res@SeNPs治疗对AD模型小鼠大脑组织病理学改变和淀粉样蛋白沉积的影响。（A）H&E染色的代表性图像。比例尺：400和200 μm（放大图）。（B）海马体中7种神经递质的浓度。（C）海马体的Aβ42聚集性免疫荧光染色。比例尺：50 μm。在不同浓度的Res@SeNPs（D）和TGN-Res@SeNPs（E）存在下，Aβ42单体的RLS光谱。Aβ42=1 μg/mL；Res@SeNPs或TGN-Res@SeNPs浓度，1-8：3.5、7.0、10.5、14、17.5、21、24.5和28 μg/mL。（F）Aβ42单体在37°C下与Cu2+、Res、Res@SeNPs或TGN-Res@SesNPs孵育的聚集动力学的ThT荧光。（G）Aβ42单体与Cu2+、Res、Res@sesps或se@sesps孵育3天的形态。Aβ42=45 μg/mL，Cu2+=90 μM，Res，Res@SeNPs，或TGNRes@SeNPs=60 μg/mL。(H)体外血脑屏障模型。（I）PC12和bEnd中Res、Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的细胞摄取。血脑屏障模型中的3个细胞。（J）BBB模型中Res、Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的传输效率。（K）采用ICP-MS法检测Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs在大脑中的硒浓度。每组只=10只小鼠。数据以±标准差表示，用方差确定统计学意义。字母a-d表示不同组间的显著性差异（p<0.05）。

4 多功能硒纳米颗粒可降低氯化铝和D-gal诱导的AD小鼠的氧化应激

中枢神经元清除ROS的能力较低，使它们特别容易受到Aβ聚集物诱导的氧化应激。因此，我们研究了TGN-Res@SeNPs对氧化应激的缓解作用。Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs具有很好的DPPH和ABTS+清除活性（图S4，支持信息）。纳米颗粒对ABTS+的清除活性优于Res。在PC12细胞中，Aβ-Cu+聚集物明显降低了多种抗氧化指标，包括SOD活性、GSH、CAT活性和T-AOC活性降低（图4A-D）。用Aβ-Cu+聚集物处理后，PC12细胞中细胞内ROS的绿色DCF荧光也得到了增强（图4E）。与Aβ-Cu+聚集物相比，Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs明显增加了抗氧化指标，减少了ROS的过量产生（图4A-E）。接下来，我们通过MTT和TUNEL-DAPI共染色分析了Aβ聚集物的细胞毒性和ros诱导的细胞死亡。如图S5A、B（支持信息）所示，纳米颗粒的细胞毒性低于Res。Aβ-Cu+聚集物对PC12细胞有毒性，细胞活力降低至45.8%。Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs均抑制了Aβ的毒性，从而增强了细胞活力。据报道，Aβ聚集引起的细胞凋亡可能与ROS的过量产生有关。在TUNEL-DAPI共染色实验中，与细胞凋亡相关的DNA片段可被TUNEL染色成绿色。Aβ-Cu+聚集处理后，绿色染色的凋亡核数量明显增加，而纳米颗粒处理后，凋亡核数量明显减少（图S5C，支持信息）。这些结果表明，Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs可改善PC12细胞的抗氧化状态，抑制ros诱导的体外神经元细胞凋亡。

在AD模型小鼠中，多种氧化应激参数[T-AOC、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）]的水平显著降低，而大脑和血清中的MDA水平显著升高（图4F-M）。口服Res@SeNPs和TGN-Res@senes后，AD模型小鼠的T-AOC、CAT和GSH-Px水平显著升高。同时，MDA水平降低到正常，表明Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs表现出优越的抗氧化能力，并在体内有效降低氧化应激。

图4. TGN-Res@SeNPs在体内外均降低了AD相关的氧化应激。在Aβ42-Cu2+聚集处理的PC12细胞中，增加TGN-Res@SeNPs的SOD（A）、CAT（B）、GSH（C）的含量和增强T-AOC(D)的活性。TGN-Res@SeNPs（E）降低了PC12细胞内ROS的形成水平。比例尺：50 μm。在AD模型小鼠的大脑中检测到T-AOC（F）、CAT活性（G）、GSH-Px活性（H）和MDA浓度（I）。测定AD模型小鼠血清T-AOC（J）、CAT活性（K）、GSH-Px活性（L）和MDA浓度（M）。每组只=10只小鼠。数据以±标准差表示，用方差确定统计学意义。字母a-d表示不同组间的显著性差异（p<0.05）。

5 多功能硒纳米颗粒抑制氯化铝和D-gal诱导的AD小鼠的炎症

小胶质细胞是大脑中驻留的免疫细胞，可以被Aβ聚集物激活。慢性小胶质细胞激活会引起神经炎症，从而导致AD发病过程中的神经元死亡。为了评估TGN-Res@SeNPs对神经炎症的影响，我们用小胶质细胞标记物IBA1和星形胶质细胞标记物GFAP对脑样本进行染色。图5A显示，AD模型小鼠海马IBA1和GFAP阳性细胞明显增加。Res和Res@SeNPs略微改善了小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。TGN-Res@SeNPs显著降低了IBA1和GFAP的免疫反应性，具有最强的抑制作用。小胶质细胞和星形胶质细胞的激活会产生大量与炎症相关的细胞因子，如iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α。因此，采用ELISA和westernblot检测炎症因子水平。AD模型小鼠的脑和血清中炎症细胞因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度明显高于对照组（图5B-I）。在AD模型小鼠中，iNOS和COX-2的蛋白表达水平也有所升高（图5J）。每日摄入TGN-Res@SeNPs在降低iNOS和COX-2蛋白表达、IL-1β、IL-6、TNF-6和TNF-α水平方面的作用强于Res和Res@SeNPs，同时提高IL-10水平。IL-10具有抑制活化的巨噬细胞过度产生炎症细胞因子的能力。这些结果表明，TGN-Res@SeNPs抑制体内小胶质细胞的过度激活，逆转炎症因子的改变。

NFκB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通过调节关键炎症介质的生物合成，包括iNOS、COX-2、TNF-α和白细胞介素（IL），在神经退行性疾病中发挥重要作用。在生理条件下，NFκB通过与核因子-κB（IκB）抑制剂结合，以非活性的形式捕获在细胞质中。刺激后，IκB改变为磷酸化状态，导致IκBα的降解。NFκB随后从IκB中释放，使其易位到细胞核并激活炎症因子分泌过程。如图5K所示，AD小鼠中p-Iκβ、核p65和核NFκB显著增加，而TGN-Res@SeNPs显著下调。这一结果表明，TGN-Res@SeNPs可以抑制NFκB的激活。

NF-κB信号通路的激活与MAPKs和AKT密切相关。MAPKs是由ERK、c-Junn端激酶（JNK）和p38组成的蛋白激酶。据报道，中药配方三威口汤通过体内外MAPK信号通路改善Aβ诱导的炎症相关细胞因子COX-2、INOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。抑制p38和ERK的磷酸化可显著降低Aβ诱导的NF-κB的激活。既往研究表明，Aβ诱导的PC12细胞凋亡与NF-κB及其上游激酶ERK和p38的激活有关。在我们的研究中，我们发现磷酸化的ERK、JNK和P38蛋白表达水平显著升高，而Res@SeNPs和TGN-Res@senps蛋白表达水平下调（图5L）。此外，活化的Akt也被证明在lps诱导的BV-2小胶质细胞的炎症反应和NF-κB激活中发挥重要作用。我们的研究发现，Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs也能抑制AD模型小鼠大脑中Akt的磷酸化。

TGN-Res@SeNPs对Aβ诱导的炎症的影响。小胶质细胞模型BV-2被广泛用于神经炎症机制的研究。我们使用较低的Aβ聚集物诱导BV-2细胞，并生成AD样神经炎症细胞模型。如图S6（支持信息）所示，Aβ聚集诱导NO和炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的过量产生，Res、Res@SeNPs和Res@SeNPs显著降低NO和炎症细胞因子的过度产生。与Aβ聚集物相比，Res@SeNPs组和TGN-Res@SeNPs组的抗炎细胞因子IL-10水平升高，而Res组没有升高。与纳米颗粒在体内的抗炎作用一致，p-Akt-、NFκB-和p-Iκβ、核p65、pNFκB、p-ERKs、p-REPs和p-P38的表达显著下调 (图S7，支持信息)。综上所述，我们的体内和体外研究结果表明，TGN-Res@SeNPs可以通过NFκB/MAPK/Akt信号通路抑制Aβ聚集诱导的神经炎症。

图5. TGN-Res@SeNPs对AD相关神经炎症的影响。（A）小鼠海马切片中小胶质细胞激活标志物IBA1（红色）和星形胶质细胞激活标志物GAFP（绿色）的免疫荧光检测。用DAPI法进行核染色（蓝色）。比例尺：50 μm。大脑中IL-1β(B)、IL-6(C)、TNF-α(D)和IL-10(E)的释放水平。小鼠血清中的IL-1β（F）、IL-6（G）、TNF-α（H）和IL-10（I）的浓度。(J)采用免疫印迹法检测海马体中iNO和COX-2蛋白的表达水平。（K）海马中p-IκB、IκB、核P65、细胞质P65、核NFκB和细胞质NFκB的蛋白表达水平。（L）海马中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-AKT、AKT、p-P38和P38的蛋白表达水平。每组只=10只小鼠。数据以±标准差表示，用方差确定统计学意义。字母a-d表示不同组间的显著性差异 (p<0.05)。

6 多功能硒纳米颗粒恢复氯化铝和D-gal诱导的AD小鼠肠道微生物群失衡

外源性或内源性因素可能改变肠道屏障炎症通透性的结果。血清d-lac和LPS水平通常被用作肠道通透性的指标。检测血清中d-lac和LPS浓度，评估肠屏障功能障碍。如图S8（支持信息）所示，与对照组相比，AD模型小鼠中d-lac和LPS水平显著升高，而Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs显著降低了血清中d-lac和LPS水平。为了进一步评估肠道屏障的完整性，我们通过免疫染色染色检测了肠道屏障中必需的紧密连接蛋白（claudin-1和ZO-1）的表达。如图S8C-E（支持信息）所示，TGN-Res@senps显著提高了claudin-1和ZO-1的表达水平，这与TGN-Res@SeNPs在降低血清中LPS浓度方面的预防作用一致。因此，TGN-Res@SeNPs可能通过增强必需的紧密连接蛋白的表达水平来保护肠道屏障。

肠道微生物群在AD的进展中起着重要作用。为了评估TGN-Res@SeNPs对AD模型小鼠肠道微生物群的影响，我们采用16SrRNA基因测序方法分析肠道含量。α-多样性（Sobs指数、Chao指数和Shannon指数）反映了补充TGN-Res@SeNPs可以提高AD模型小鼠微生物群落的多样性和丰度（图S9，支持信息）。与预期的一样，Venn图显示，与其他组相比，TGN-Res@SeNPs治疗与更多特异性的OTUs相关（图6A）。PCoA结果显示，AD模型小鼠的肠道微生物群发生了显著变化，样本分散和聚集分布远非对照组（图6B）。对Res、Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs的补充显然改变了这个配置文件。显著的是，TGN-Res@SeNPs的样本分布区域与对照组重叠。

利用LEfSe鉴定从门到类群间发生显著变化的特定类群（图6C，D）。AD模型小鼠中的g_Lachnospiraceae_NK4A136_group, f_Rikenellaceae, g_Alistipes, f_Marinififilaceae, o_Campylobacterales, g_Odoribacter, p_Epsilonbacteraeota, f_Helicobacteraceae, c_Campylobacteria, g_Helicobacter和g_Rikenella。然而，f_Lactobacillaceae, g_Lactobacillus, o_Erysipelotrichales, c_Erysipelotrichia, f_Erysipelotrichaceae和g_[Eubacterium] 产粪甾醇群在TGN-Res@SeNPs上存在差异。

本文还在属水平上进一步分析了肠道微生物群组成的变化（图7A）。基因水平分析显示，与对照组相比，AD模型小鼠中脱硫弧菌、Candidatus、Saccharimonas、瘤胃球菌_UCG-014、Lachnoclostridium、肠杆菌、粪杆菌的相对丰度显著降低，而毛螺菌_NK4A136_群、Alistipes、Odoribacter、幽门螺杆菌和理研菌的相对丰度显著增加（图7B）。据报道，在Aβ42诱导的AD小鼠中，Alistipes和理研菌的丰度增加，而有益菌如脱硫弧菌的丰度减少。我们的研究结果证实了这一发现。简而言之，由于致病菌丰度增加和有益菌丰度减少，AD小鼠的肠道微生物群组成紊乱。只有补充TGN-Res@SeNPs才能通过减少致病菌和富集有益细菌来恢复AD小鼠的微生物破坏。

通过Spearman相关分析，评估了大脑中改变的属、炎症细胞因子和氧化应激因子之间的相关性。如图8所示，5个细菌属（幽门螺杆菌、Lachnospiraceae_NK4A136_群、理研菌、Alistipes和Odoribacter）与抗氧化呈负相关，与炎症呈正相关。幽门螺杆菌、Alistipes和理研菌的致病属作为致病菌或机会致病菌，具有诱导小鼠炎症的能力。特别是Alistipes在Aβ42诱导的AD小鼠中与促炎因子呈正相关。此外，Alistipes、幽门螺杆菌和脱硫弧菌被鉴定为与氧化应激状态相关的常见细菌。例如，Alistipes和幽门螺杆菌与ROS呈正相关，与SOD和GSH呈负相关。而SOD和GSH与脱硫弧菌呈正相关。促进脱硫弧菌有助于改善高脂肪饮食诱导的认知能力下降和神经炎症。我们的研究结果与之前的研究结果一致，表明补充TGN-Res@SeNPs可以通过恢复肠道生态失调来缓解氧化应激和神经炎症。重要的是，只有TGN-Res@SeNPs治疗才能使粪杆菌增加到正常水平，并与IL10呈正相关。粪通过抑制TNBS诱导的结肠炎中IL-8的表达和NF-κB的激活来减轻炎症。因此，TGN-Res@SeNPs在体内的效果优于Res@SeNPs。

图6. TGN-Res@SeNPs对AD模型小鼠肠道微生物群的影响。（A）Venn图。（B）PCoA说明了不同治疗组间OTUs的差异。（C）门与属的LEfSe比较结果。（D）线性判别分析。每组只=5只小鼠。

 图7. TGN-Res@SeNPs对AD模型小鼠特定肠道微生物群组成的影响。（A）各类群在属水平上的肠道微生物类群组成。（B）五组间发生显著变化的微生物采用秩和检验。每组只=5只小鼠。数据以平均±标准差表示。采用方差分析确定有统计学意义。字母a-c表示不同组间的显著性差异（p<0.05）。

 图8. AD模型小鼠生化指标与特异性肠道菌群组成的相关性分析。盒子的颜色显示了相关指数的水平。*p<0.05，**p<0.01。

7 纳米颗粒的毒性

肝脏和肾脏的功能变化可以反映纳米颗粒在体内的毒性。血清中的AST、ALT、总胆汁酸（TBA）和肌酐（CRE）水平是评价肝功能和肾功能的重要生物标志物。如图S10A-D（支持信息）所示，在AD模型小鼠中，AST、ALT、TBA和CRE显著升高，表明氯化铝对小鼠有毒性。Res和纳米颗粒显著减轻了氯化铝的毒性，这些生物标志物降低到几乎正常水平。我们还评估了肝脏和肾脏中的氧化指标（T-AOC、CAT、GSH-Px和MDA）。Res和纳米颗粒能够显著提高抗氧化指标（T-AOC、CAT和GSH-Px）的水平，并降低MDA的水平（图S10E-L，支持信息）。这些结果表明，Res@SeNPs和TGN-Res@SeNPs没有毒性作用，可长期改善肝脏和肾脏的抗氧化状态。

结论

TGN-Res@SeNPs对氯化铝和D-gal诱导的AD的有益作用可能是由于抑制Aβ聚集，改善Aβ诱导的毒性，恢复肠道微生物群平衡。TGN-Res@SeNPs由于转运效率高，对肠道微生物群有调节作用，在提高体内认知能力方面优于Res@SeNPs和Res。