转录因子KLF14通过抑制HK2调节脓毒症巨噬细胞糖酵解

上海交通大学医学院附属第一人民医院麻醉科李金宝教授团队于2022年1月在著名免疫学杂志《Cellular & Molecular Immunology》发表题目为《The transcription factor KLF14 regulates macrophage glycolysis and immune function by inhibiting HK2 in sepsis》的文章。  

本文第一作者为袁圆、范广健、刘玉齐，通讯作者为姚良芳、陈峰和李金宝教授。    

【背景介绍】 脓毒症是全球范围内的主要死亡原因，被定义为因宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的多器官功能障碍。单核巨噬细胞是先天性免疫和获得性免疫之间的桥梁。在脓毒症早期，活化的单核巨噬细胞吞噬病原体，发挥抗原呈递功能，并分泌促炎细胞因子。随着脓毒症发展到免疫抑制阶段，巨噬细胞的吞噬、抗原呈递、促炎因子的分泌等免疫功能受到抑制。研究表明，单核巨噬细胞的功能状态与脓毒症患者的死亡率密切相关。同时，巨噬细胞的功能与糖酵解密切相关，调节糖酵解水平可以提高巨噬细胞的免疫功能。因此，寻找调节免疫细胞功能的关键代谢靶点成为脓毒症治疗领域的研究热点。 Krüppel-like转录因子（transcription factors, KLFs）具有多种生物调节功能，参与细胞增殖、分化、凋亡等重要病理过程。研究结果表明，KLFs广泛分布于心血管、呼吸、胃肠道和免疫系统。KLF14是SP/KLF家族的成员，在其c端包含一个锌指结构，在开放阅读框（ORF）的区域有一个巨大的CpG岛，这个富含CG的区域通过与共激活因子或免疫复合物相互作用调控下游基因表达和核蛋白转录。既往研究显示KLF14显著调节脂质代谢和血糖水平，与动脉粥样硬化、2型糖尿病、胰岛素抵抗等疾病的发病机制密切相关。近期研究表明，KLF14通过与Treg细胞的一种特异性去甲基化增强子结合，参与了Treg细胞的分化。此外，KLF14还调控细胞信号通路和免疫功能。虽然越来越多的证据证实了KLF14对免疫和代谢的影响，但目前尚未报道KLF14是否可以通过糖酵解作用影响巨噬细胞的免疫功能。 为了进一步了解KLF14在脓毒症炎症反应调控中的作用，作者首次观察到KLF14在脓毒症患者和脓毒症小鼠的巨噬细胞表达增加。然后，作者探讨了KLF14在脓毒症巨噬细胞免疫功能中的体外功能作用，阐明了KLF14在脓毒症巨噬细胞免疫功能中的作用机制。这项研究为脓毒症引起的免疫功能障碍提供了一个新的解释，表明KLF14-HK2信号通路可以影响巨噬细胞的免疫功能，提示KLF14是一个潜在的脓毒症的治疗靶点。 

【数据介绍】   巨噬细胞作为宿主防御的第一道防线，在脓毒症的病理生理过程中发挥着重要作用。巨噬细胞的免疫功能对脓毒症患者的预后至关重要，其代谢状态可直接影响其免疫功能，但其作用机制尚未阐明。在本文中，作者的研究结果确定了KLF14作为一种关键的介质，可以影响巨噬细胞的免疫功能。作者提供证据支持KLF14在脓毒症期间通过抑制HK2的转录抑制巨噬细胞的糖酵解。此外，KLF14的药理激活可保护小鼠免受脓毒症的感染，支持KLF14激动剂在治疗脓毒症方面的治疗潜力。 首先，作者发现在脓毒症的在体和体外模型中，KLF14在巨噬细胞中上调（图1）。KLF14在严重的脓毒症小鼠模型中的外周血单核细胞（PBMCs）及多个组织中表达增加（图1A-D）。因此，转录因子KLF14参与了脓毒症的过程。然后，作者在离体实验中也发现，KLF14在RAW264.7细胞、THP-1诱导的巨噬细胞和BMDMs中的表达量在LPS刺激下呈时间依赖性增加（图1E-J）。作者还观察到脓毒症小鼠肺组织中KLF14和F4/80（巨噬细胞的标记物）的表达上调（图1K）。这些结果都提示KLF14参与了脓毒症巨噬细胞的炎症免疫调节。  

图1 在体和体外研究表明，在小鼠脓毒症模型中，KLF14在巨噬细胞中的表达上调 

在进一步实验，作者发现KLF14缺失可显著降低脓毒症小鼠生存率，加重肺组织损伤情况（图2）。并且发现脓毒症小鼠肺内浸润的巨噬细胞数量高于对照组，且KLF14-/-脓毒症小鼠肺内F4/80荧光强度显著高于WT脓毒症小鼠肺内（图2E，F）。此外，有报道称KLF14是一个母系印记基因；因此，作者也建立了雌性小鼠脓毒症模型，结果显示KLF14的缺失也增加了雌性脓毒症小鼠的炎症水平。这些结果表明，KLF14-/-小鼠脓毒症模型的炎症反应增强。  

图2 KLF14缺失可显著诱导小鼠内毒素血症和脓毒症模型发生严重炎症反应 

为了进一步了解KLF14对脓毒症时巨噬细胞免疫应答的影响，作者以WT C57BL/6小鼠为受体进行移植实验。将WT 小鼠或KLF14−/−小鼠的骨髓细胞移植到WT小鼠中，移植后8周，建立小鼠内毒素血症和脓毒症模型。作者通过HE染色和q-PCR实验观察肺组织损伤情况。结果表明,WT小鼠接受KLF14−/−骨髓细胞移植后，脓毒症时肺组织有更严重的炎症反应。 在体外研究中，作者培养了WT和KLF14−/−小鼠的BMDMs（图3A）。作者发现KLF14−/−BMDMs对LPS刺激的反应更强烈（图3B）。此外，作者进一步观察了KLF14在RAW264.7细胞中的调控作用。KLF14质粒转染后（图3E），结果显示，与对照组相比，LPS刺激过表达KLF14的RAW264.7细胞中炎症因子的mRNA和蛋白水平降低（图3F,G）。这些结果进一步证实了KLF14在巨噬细胞免疫应答中的调节作用。此外，作者的结果还表明，KLF14的缺失会影响LPS刺激下巨噬细胞的乳酸分泌、吞噬和葡萄糖摄取（图3I-K）。这些结果表明，KLF14在脓毒症巨噬细胞的免疫应答中发挥了关键作用。  

图3 KLF14在脓毒症巨噬细胞的免疫应答中起着至关重要的作用 

当巨噬细胞受到外界刺激时，巨噬细胞的新陈代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，以更快地生成ATP。作者评估了巨噬细胞的两种主要代谢模式:糖酵解和线粒体代谢。利用Seahorse XFe96分析仪测量糖酵解和线粒体代谢活性，结果表明,无论有没有LPS刺激，KLF14−/− BMDMs糖酵解水平显著高于在WT BMDMs（图4A、B）。然而,线粒体代谢水平KLF14−/−BMDMs组和WT组没有显著不同（图4C, D）。这些发现表明KLF14可能通过影响脓毒症期间的糖酵解来作为巨噬细胞免疫应答的关键调节因子。  

图4 KLF14调节巨噬细胞的糖酵解活性 

为了研究KLF14调控巨噬细胞糖酵解的靶点，作者评估了巨噬细胞中糖酵解酶的mRNA表达。结果显示，与WT BMDMs相比，KLF14−/−BMDMs中部分糖酵解酶的表达显著增加（图5A）。作者观察到，与WT BMDMs相比，KLF14−/−BMDMs中关键的糖酵解酶HK2在LPS刺激下显著增加（图5A）。后期，作者利用双荧光素酶报告基因实验及KLF14点突变质粒（KLF14-ΔZF2）证实了KLF14通过与HK2启动子结合调控其转录。此外，作者利用ChIP实验，验证了KLF14对HK2启动子的调控功能（图5I）。

图5 KLF14通过抑制HK2的转录来调节巨噬细胞中的糖酵解 

为了确定KLF14在脓毒症患者中是否发生改变并具有临床意义，作者收集了脓毒症患者和对照组的PBMCs。与对照组相比，脓毒症患者PBMCs中KLF14 mRNA和蛋白表达水平升高（图6A, B）。作者进一步分析GEO数据库中脓毒症患者的生物学信息。结果显示KLF14在脓毒症患者中的表达明显高于对照组（图6C）。通过对KLF14表达上调的脓毒症患者样本进行基因集富集分析（GSEA），作者还发现KLF14主要富集在与2型糖尿病和蔗糖信号通路相关的通路中（图6D），揭示了KLF14与葡萄糖代谢通路的相关性。这些发现进一步支持了KLF14在脓毒症患者中的潜在调控作用。  

图6 KLF14在脓毒症患者中表达上调 

以往的研究结果表明KLF14可能在人类脓毒症中发挥了重要的临床作用。此外，研究发现心血管药物Perhexiline可以通过靶向KLF14通路，上调ApoA1，改善动脉粥样硬化的发展，从而诱导KLF14表达，提高血液HDL-C水平和胆固醇流出能力。值得注意的是，作者的结果表明，Perhexiline可以诱导小鼠肺组织中KLF14 mRNA的表达（图7A），并显著延长脓毒症小鼠的生存时间（图7B, C），降低了肺组织损伤程度（图7D, E）。综上所述，这些结果表明，Perhexiline作为KLF14的一种激动剂，在脓毒症的治疗中具有潜在的作用。 

 图7 Perhexiline，KLF14的一种激动剂，能显著减轻内毒素和脓毒症小鼠的炎症状态 【总结】  

撰稿人：周宇 

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34983946/ 

来源：市一麻醉

打赏