「白求恩·肿瘤病理学社」项目之「三甲病理现场」，旨在促进国内相关疾病病理诊断的规范化、增强相关分子检测意识，提高诊断水平。

第十六场直播会议中复旦大学附属肿瘤医院孔蕴毅教授的分享主题是《黑色素瘤病理诊断临床实践指南（2021版）解读：免疫组化和分子检测在诊断中的应用》，本文为大家带来配套的学习笔记。

 一、黑色素细胞特异性免疫组化标志物

黑色素瘤细胞形态多样，特别是无色素病例，在临床中易与癌、肉瘤和淋巴瘤等多种肿瘤相混淆，在临床中要借助免疫组化来进行鉴别诊断。

在黑色素瘤病理诊断临床实践指南 (2021版)中，推荐的常用标志物包括：SOX-10、S-100、HMB45、Melanie-A、PNL2、Tyrosinase（酪氨酸酶）以及MITF。

1、S-100

敏感性可达97-100%，但特异性较低；只能作为黑色素细胞的筛选标记，不宜单独使用，在前哨淋巴结免疫组化评估中，由于淋巴结中众多的组织细胞及树突状细胞均可表达 S-100 蛋白，容易产生干扰；S-100对于识别单个或小灶的黑色素瘤转移灶较困难。 

2、 SOX-10

敏感性可达97-100%，和S-100相比，特异性相对较高；而且阳性表达是核定位，推荐在前哨转移IHC中应用。

3、 HMB45

敏感性可达70~90%，特异性较好；是前黑色素小体复合物中的糖蛋白；阳性定位在胞浆，有时呈颗粒状阳性；主要表达在受激惹的上皮样黑色素细胞中；在黑色素瘤（MM）中往往为弥漫性表达；在色素痣中以交界或浅表阳性为主，深部递减或转为阴性；但在特殊类型如蓝痣、深部穿通痣可表达为弥漫阳性，临床鉴别诊断中要注意区分。

4、 Melanie-A（A103）

敏感性约为85~97%，特异性可达95~100%；与HMB45同属gp100/PMe117一组的抗体，表达阳性率略高于HMB45；阳性定位在细胞质；由于可以表达于肾上腺皮质和卵巢性索间质肿瘤，因此在转移性肿瘤鉴别中需特别注意。

5、 PNL2

是2003新发现的一种单克隆抗体，是从黑色素细胞株中提取的复合物。敏感性高（梭形细胞阳性率高达80%），特异性较高，在正常组织中除了黑色素细胞外仅发现粒细胞表达；阳性表达方式类似于HMB45。

6、 Tyrosinase（酪氨酸酶）

敏感性超过80%，特异性高达97~100%，偶尔有报道AFX中多核巨细胞阳性，是黑色素小体内含的酪氨酸酶相关抗体。

7、 MITF

是黑色素细胞核蛋白，阳性定位于细胞核，但在组织细胞以及众多肿瘤细胞（间叶肿瘤和淋巴瘤等）中均可表达，特异性不高；在SLN中不推荐使用，价值有限。

 二、免疫组化在前哨淋巴结中的应用

1、 免疫组化的应用价值

在目前的NCCN指南和AJCC中都推荐，在黑色素瘤（MM）患者的前哨淋巴结评估中必须使用免疫组化。主要原因在于：

HE切片中通常只能发现已经成巢或者成片的肿瘤细胞

HE切片中吞噬黑色素的组织细胞与小灶及散在的单个黑色素瘤细胞难以区分

免疫组化染色采用AEC染色红色定位信号，可成功排除SLN中色素的干扰

在对复旦大学附属肿瘤医院2010-2016年间进行了SLN活检并行免疫组织化学的126例黑色素瘤（MM）病例进行回顾性分析后，发现联合免疫组化与常规HE染色相比可提高12.1%的SLN阳性检出率（图1）。

图1 2、 常用免疫组化标志物

SOX-10   ：有独特的优势，敏感度高达100%，特异度也较高，细胞核阳性易于观察及鉴别，且能显示微小转移灶Melan-A：可提高诊断整体的敏感性及特异度

PNL2   ：敏感性及特异性均较高HMB45：特异性较高，但梭形促纤维增生性黑色素瘤细胞常阴性

S-100   ：敏感性高，但特异性较低，对于识别单个或小灶的黑色素瘤转移灶较困难 

推荐由SOX-10、Melan-A、PNL2、HMB45这四种标志物进行联合检测

3、 病例展示

通过3个病例的展示，我们可以明显看出免疫组化在前哨淋巴结中的重要作用

病例1：被膜下HE切片发现转移灶，进行免疫组化后，HBM45呈阴性、S100和Melan-A阳性，确认为黑色素瘤。

图2

病例2：被膜下HE切片发现吞噬黑色素细胞沉积，为确认是否为黑色素转移细胞进行免疫组化确认。Melan-A和HMB45胞浆阳性、SOX-10也为阳性，确认是黑色素瘤转移细胞。

图3

病例3：

在淋巴结实质内，HE切片并没有显示出明显的转移病灶。但经过免疫组化发现，在Melan-A、HMB45和SOX-10都看到了一些黑色素瘤细胞转移灶，确诊为黑色素瘤转移。

图4

 三、免疫组化在黑色素肿瘤良恶性鉴别中的应用

1、免疫组化标志物

在黑色素瘤病理诊断临床实践指南 (2021版)中，推荐了5个抗体在鉴别诊断中使用，分别是：HMB45、P16、Ki-67、CyclinD1和PHH3。

HMB45：在黑色素瘤（MM）中为弥漫性表达；在色素痣中以交界或浅表阳性为主，深部递减或转为阴性；在特殊类型如蓝痣、深部穿通痣可表达为弥漫阳性

P16：色素痣中阳性率高，恶黑中阴性比例高，Spitz肿瘤诊断中P16表达对于诊断有一定帮助。 

Ki-67：很难从Ki-67指数的绝对值上判断肿瘤的良恶性，通常我们会观察在HE形态下，被怀疑为恶性的区域或黑色素肿瘤深部区域的Ki-67是否升高，以此作为辅助指标判断。

CyclinD1：弥漫性强阳性，倾向为黑色素瘤（MM）

PHH3：有助于计数核分裂象  

2、病例展示

病例1：肢端复合痣病变，HMB45交界表达为主，P16弥漫表达，Ki-67深部复合成分极低表达。支持诊断为良性黑色素肿瘤。

图5

病例2：黑色素瘤（MM）与色素痣中HMB45和CyclinD1的不同

图6

 四、免疫组化的其他应用

1、 早期指甲原位黑色素瘤诊断

早期甲下黑色素瘤中，瘤细胞往往体积较小且细胞散在，通过SOX-10或Melanie-A可以帮助定位在甲床上皮或甲母痣上皮散在分布的肿瘤细胞，便于观察其密度和分布情况。

2、 伴有消退的黑色素瘤（MM）

消退的黑色素瘤中会有大量的淋巴细胞、组织细胞、浆细胞和黑色素瘤细胞混杂在一起，通过免疫组化帮助准确评估浸润深度。

3、 Spitz肿瘤

通过检测ALK蛋白帮助判断在Spitz肿瘤中是否存在ALK基因相关易位，可能对于预后判断有一定帮助。

4、 转移性黑色素瘤鉴别

少数转移性黑色素瘤细胞转移后会出现去分化或转分化的现象，偶见CK+、DES+，需要结合临床病史综合判断

 五、 多位点荧光原位杂交 ( FISH )在黑色素瘤诊断中的价值

1、简介

近年来逐渐运用于临床的辅助检测手段，主要来自于大量经典黑色素瘤（MM）比较基因组杂交的检测结果，研究发现黑色素瘤中常存在多条染色体、多个位点的丢失或增加，而良性色素痣则不太会出现上述改变。

图7

2、多位点探针法

目前的二代黑色素瘤FISH检测包括了两组探针，文献报道经典四色探针的特异性可以达到94~100%，灵敏度60~100%，联合联合CDKN2A和MYC探针后灵敏度可提高15~20%。

1. 经典四色探针:

• CCND1、RREB1、MYB、6号染色体着丝粒

• 出现任何一个位点异常即为阳性结果（图8)

图8

病例展示：1例黑色素瘤病例组织学形态及第一代组合FISH检测阳性结果（图9.1-9.6） 图9.1示弥漫浸润真皮层的黑色素瘤细胞HE中倍放大；图9.2示红、绿、金、青4种信号综合通道下FISH阳性结果；图9.3示RREB1基因红色红色信号数目增加；图9.4示CCND1基因绿色信号数目增加；图9.5示MYB基因金色信号数目相较于CEP6情色信号数目（图9.6）减少（图9.2-9.6 FISH×1000）  

图9.1-9.6     2.补充双色探针:

MYC、CDKN2A、9号染色体着丝粒

出现任何一个位点异常即为阳性结果（图10）

图10

病例展示：1例黑色素瘤组织学形态及CDKN2A、CEP9、MYC组合FISH检测结果（图9.7-9.10)

图9.7示肿瘤细胞弥漫浸润性生长HE高倍放大；图9.8示红、绿、青3种信号综合通道下FISH海洋性结果；图9.9示CDKN2A基因红色信号相对于CEP9绿色信号（右下角）完全丢失提示CDKN2A基因呈纯合性缺失；图9.10示MYC基因情色信号数目增加（图9.7-9.10 FISH×1000）      

图9.1-9.10

3、注意事项

判读位点、标准较多，需要在有一定经验和资质的实验室开展

判读前需准确定位HE形态下的可疑肿瘤区域

色素较多的病例，影响FISH信号着色，需选择色素少的区域进行观察

无论是免疫组化还是分子检测，都要紧密结合临床信息和组织学特点，以达到更高的准确性

参考资料： 1. 中华病理学杂志, 2018, 47(5), 360-365 2. 中华病理学杂志, 2021, 50(5), 494-499 3. 中华病理学杂志, 2020, 49(8), 827-833

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