科研快讯 | 南开大学：肠道微生物对CD95介导的肝损伤具有保护作用

编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。

导读  

南开大学生命科学学院吴震州团队等人于2022年2月6日在Gut Microbes发表题为《Bacteroides acidifaciens in the gut plays a protective role against CD95-mediated liver injury》的文章。肠道微生物在许多人类和动物疾病的发展中起着重要作用。微生物组相关的研究揭示了肠道细菌在许多肝病中的潜在调节功能，如自身免疫性肝炎、病毒性肝炎和酒精性肝炎。然而，影响肝脏病理损伤的关键肠道细菌菌株及其作用机制尚不清楚。在本研究中，我们发现，与万古霉素（Van）处理的小鼠相比，庆大霉素（Gen）处理的小鼠的肠道菌群可以通过抑制肝细胞表面CD95的表达和减少CD95/CD95l介导的肝细胞凋亡，显著缓解刀豆素A（ConA）诱导的肝损伤。通过微生物测序和相关性分析，从Gen处理小鼠的粪便中分离到5株相对丰富度最高的菌株，Bacteroides acidifaciens（BA）、Parabacteroides distasonis（PD）、Bacteroides thetaiotaomicron（BT）、Bacteroides dorei（BD）和Bactero uniformis（BU）。只有BA对ConA诱导的肝损伤有保护作用。进一步的研究表明，BA重组的小鼠CD95/CD95L信号通路降低，这是肝脏中L-谷胱甘肽/谷胱甘肽（GSSG/GSH）比值降低所必需的。Ba重组的小鼠对酒精性肝损伤也有较强的抵抗力。我们的研究表明，一种特殊的小鼠肠道菌株BA，可以通过CD95依赖的方式减少肝细胞凋亡，从而改善肝损伤。对BA功能的鉴定可能为未来用作肝脏疾病的治疗提供新的机会。

关键词：肝炎、肠道微生物、肠道微生物失调、CD95、GSH

论文ID

原名：Bacteroides acidifaciens in the gut plays a protective role against CD95-mediated liver injury

译名：肠道中的Bacteroides acidifaciens对CD95介导的肝损伤具有保护作用

期刊：Gut Microbes    

IF：10.245

发表时间：2022.02.06

通讯作者：吴震州

通讯作者单位：南开大学生命科学学院

DOI号：10.1080/19490976.2022.2027853

实验设计

选择C57BL/6雄性小鼠为试验对象，使用鸡尾酒抗生素耗竭小鼠的肠道微生物（Abx组）。同时使用万古霉素（Van）、庆大霉素（Gen）和无菌水给药小鼠一周，采集Van、Gen小鼠粪便进行微生物移植进行微生物重组。通过刀豆素A诱导构建小鼠肝炎模型，通过抗CD95 mAb Jo2来诱导CD95介导的小鼠肝损伤，通过酒精诱导酒精性肝炎。测定小鼠肠道微生物群落改变、肝脏组织染色切片、测定血浆肝脏GSH和GSSG水平以及血清细胞因子水平、TUNEL凋亡检测、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。探究Bacteroides acidifaciens对CD95介导的肝损伤的保护作用。

结果

图1. 不同抗生素处理的C57BL/6雄性小鼠对ConA诱导的肝炎有不同程度的敏感性。（a）ConA处理12 h后小鼠肝脏切片H&E染色及相应坏死区域大小（n = 8）；（b）在指定时间点测定小鼠血清ALT水平（n = 8）；（c）抗生素处理后小鼠的体重变化（n = 8）；（d，e）不同处理小鼠具有代表性的盲肠图像（n = 3-5）；（f）ConA 处理后8 h结肠组织切片H&E染色；（g）小鼠血清FITC-Dextran荧光强度（n = 8）；黑色*代表Vehicle vs. Gen；红色*代表Van vs. Gen，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001；比例尺，100 μm。

图2. 抗生素处理改变了肠道微生物的组成；采用16srRNA序列对抗生素处理后小鼠粪便DNA进行测序，每组6-8只小鼠。（a，b）厚壁菌门/拟杆菌门比值和变形菌门/拟杆菌门比值；（c）Alpha多样性分析；（d）主坐标分析；（e）在门水平上，显著改变的分类群的相对丰度；（f）在属水平上，显著改变的分类群的相对丰度的热图；（g）在物种水平上，显著改变的分类群的相对丰度；（h）在Gen处理的小鼠（前5个）和Van处理的小鼠（前1个）中丰度显著增加的物种；柱状图表示均值±s.d，* p < 0.05， *** p < 0.001。

图3. ConA诱导的肝损伤易感性受共生细菌的调节。（a）实验步骤；（b）微生物群落缺失的受体小鼠接受来自供体小鼠的粪便移植，在ConA给药后12 h测量血清ALT水平（n = 6-8）；（c、d、e、f）显示了在ConA给药后12 h小鼠肝脏切片具有代表性的H&E和TUNEL染色以及相应坏死区域的大小（n = 6-8）；（g）ConA给药后12 h用或不用Abx处理的Van和Gen处理小鼠血清ALT水平和肝脏切片H＆E染色图以及坏死区域的大小（每组n = 5-8只小鼠）；* P < 0.05，*** P < 0.001，比例尺，200 μm（e），100 μm（f），200 μm（g）。

图4. 肠道微生物重组小鼠肝损伤程度的差异与IFN-γ和 TNF-α无关。（a）在给药ConA后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h，Van或Gen处理的小鼠血清中的IFN-γ和TNF-α细胞因子谱（n = 8）；（b）供体小鼠的粪便细菌移植的Abx处理受体小鼠，在ConA给药后12 h是IFN-γ和TNF-α水平（n = 6-8）。

图5. Van和Gen诱导的小鼠肝损伤敏感性改变是由Cd95介导的细胞凋亡依赖性产生的。ConA给药后12 h肝脏切片中的TUNEL检测（a）和CD95（b）的IHC染色（n = 9）；（c）在0小时（ConA给药前）和ConA给药后2小时，CD95，CD95L和Bcl2在小鼠肝脏中的相对表达量（n = 6-8）；（d）ConA给药后8小时肝脏中CD95和cleaved caspase-3水平（n = 6）；（e）以0.2 µg g-1的剂量给小鼠注射抗CD95（Jo2）12 h后血液ALT（n = 7）；肝组织的H&E染色（f）和TUNEL检测（g），以及给药8 h后肝脏切片中cleaved caspase-3表达（h）；* P < 0.05，** P < 0.01，比例尺，100 μm（a），50 μm（b），100 μm（f），100 μm（g）。

图6. B. acidifaciens重组导致Abx预处理小鼠对ConA和Jo2诱导的肝损伤的敏感性降低。（a，b）实验步骤；（c）在注射ConA后12 h血清ALT水平；用单一菌株重组并用ConA（12 h）处理的Abx小鼠肝脏切片的H&E（d）、TUNEL检测（e）和CD95 IHC染色（f）（n = 6-8）；（g）ConA注射后8小时（n = 6-8）用单一菌株（从小鼠中分离）重建的Abx预处理小鼠的CD95和cleaved caspase-3表达水平；（h）ConA注射后12 h血清IFN-γ和TNF-α水平；以0.2 µg g-1的剂量给小鼠注射抗CD95（Jo2）后12 h，BA和PD转移的Abx预处理小鼠的血清ALT水平（i），H&E染色和TUNEL检测（j）（n = 8）；（k）在Jo2给药后8 h测量的肝脏cleaved caspase-3表达水平（n = 6）；* P < 0.05，*** P < 0.001，比例尺，50 μm（d），200μm（e），50μm（f），100 μm（j）。

图7. B. acidifaciens重组可降低对酒精性肝损伤的敏感性。在酒精处理（6 g kg-1）后12 h测量血清ALT（a）和TNF-α水平（c）（n = 8）；（b）12 h时的肝脏外观；酒精处理后12 h小鼠肝脏切片具有代表性H&E（d）、Oil red O（e）和CD95 IHC（f）染色图（n = 6-8）；（g）酒精给药后8小时肝脏中CD95和cleaved caspase-3表达（n = 6），比例尺，100 μm（d，e）。50 μm （f）， * P < 0.05，*** P < 0.001。

图8. GSH抑制CD95表达和ConA诱导的肝损伤。Van和Gen处理小鼠的肝脏GSSG/GSH比值（a）、BA和PD转移的Abx预处理小鼠肝脏GSSG/GSH比值（b）（n = 7-8）；在ConA注射后12 h，Van或Gen处理的小鼠（c）和BA和PD转移的Abx预处理小鼠（d）的肝脏GSH水平（n = 6-8）；（e）ConA给药后血清ALT水平和肝脏GSH水平之间的关系（n = 21）；（f）将Hepa1-6细胞与GSH共培养24 h，并使用流式细胞荧光分选技术（FACS）对CD95阳性细胞进行定量（n = 3）;（g）在ConA注射后12 h，GSH处理的小鼠（40 mg每只）的血清ALT水平（n = 5）；（h）肝切片中CD95的H&E、TUNEL检测和IHC染色；（i，j）在GSH给药后8 h，CD95和cleaved caspase-3在肝脏中的表达（n = 4）；*** P < 0.001，**P < 0.01，* P < 0.05。

图9. BA对CD95依赖性自身免疫/酒精诱导的肝损伤的保护机制模型。抗生素诱导肠道微生物群的极化，Gen处理诱导肠中BA的富集，BA降低肝脏中的GSSG/GSH比率，可能是通过抑制肝细胞中CD95的表达，分泌一些抑制肝细胞凋亡和ConA或酒精诱导的肝损伤的代谢物。