【论肿道麻】粪菌移植克服了黑色素瘤患者对抗PD-1治疗的耐药性

抗PD-1 治疗为晚期黑色素瘤患者提供了长期的临床益处。在临床前模型和癌症患者中，肠道菌群的组成与抗PD-1疗效有关,但其确切组成尚未完全了解。为探讨是否可以通过改变肠道菌群来克服抗PD-1的耐药性，2021年，Diwakar Davar等人在《Science》杂志上发表了一篇题为《Fecal microbiota transplant overcomes resistance to anti-PD-1 therapy in melanoma patients》的文章，评估了反应源FMT联合抗PD-1治疗PD-1难治性黑色素瘤患者的安全性和有效性。现介绍如下：

背景  

靶向程序性细胞死亡蛋白1 ( PD-1 ) 的单克隆抗体( mAbs )的免疫检查点阻断为近40 %的晚期黑色素瘤患者提供了长期的临床益处。除了支持抗PD-1 mAbs (anti PD-1)耐药性的肿瘤内在机制外，肠道微生物群也是肿瘤外部对抗PD-1反应的主要调节因子。在小鼠中，肠道微生物群的组成可调节抗PD-1和抗程序性死亡配体1 (PD-L1)的治疗活性，而给予某些肠道共生菌或粪菌移植(FMT)可促进黑色素瘤小鼠的抗PD-1疗效。尽管多项研究报道，癌症患者的抗PD-1反应与良好的肠道微生物群有关，但其确切组成尚未完全了解。特别是在黑色素瘤中，属于不同门的关键细菌种类，包括放线菌门(双歧杆菌科和科里杆菌科)和厚壁菌门(疣微菌科和毛螺菌科)，在癌症患者中与针对PD-1的mAbs的良好反应有关，虽然在不同的研究中已经报道了已确认的物种之间的一致性有限。基于微生物群的治疗是否能克服晚期黑色素瘤患者对抗PD-1的耐药性尚未得到评估。为了解决这个问题，作者设计了一项单臂临床试验，以评估反应源FMT联合抗PD-1治疗PD-1难治性转移性黑色素瘤患者的安全性和有效性。

一组PD-1难治性黑色素瘤患者对FMT和抗PD-1治疗有反应  

2018年6月至2020年1月期间纳入了16名黑色素瘤患者，结果反映了截至2020年9月1日的数据。所有黑色素瘤患者均为原发难治性抗PD-1治疗患者，定义为先前对抗PD-1单独或联合抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4或研究药物没有反应的患者，并由独立的放射科医生使用实体瘤反应评估标准评估原发性进展性疾病(PD)。在纳入本试验的PD-1难治性患者中，只有1例在X线片证实PD之前对短期稳定疾病(SD)有最佳反应。所有入组患者和候选供者都进行了连续的粪便采样和广泛的感染研究，以消除传播感染因子的可能性。7名供者，包括4名完全缓解(CR)和3名部分缓解(PR)，中位无进展生存期(PFS)为56个月(范围:45-70个月)，用于治疗16名患者。在FMT前连续采集血液和粪便标本，筛选32种病毒、细菌、真菌和原生动物。单一供者来源的FMT与派姆单抗一起使用，随后每3周进行一次额外的派姆单抗治疗，直到疾病进展或不能耐受毒性。每12周(4个周期)进行一次影像学评估，使用RECIST v1.1对反应进行分类。在纳入的16例患者中，15例接受FMT和派姆单抗治疗，并至少进行了一次CT扫描，因此被认为是可评估的反应。一名FMT后临床迅速衰退的患者被认为是继发于快速疾病进展，可评估其安全性，但不能评估其反应。15例患者中有3例有客观缓解(ORs) [ORR:20%]，3例(20%)有持续SD＞12个月 (图1,A和B)。本文提供了3例ORR患者的代表性X线照片(图1C)。中位随访7个月时，所有患者的中位PFS和总生存期(OS)分别为3.0个月和7.0个月。在6例疾病控制(即OR和SD)的患者中，中位PFS和OS分别为14.0和14.0个月(图1B)。在这些患者中，1例患者在治疗＞2年后表现出持续的PR，目前正在接受监测，而4例患者仍在治疗。1例X线CR患者因椎管狭窄接受择期手术治疗，但术后患者出现了与治疗无关的脊髓梗死，随后死亡。本研究表明，在PD-1难治性黑色素瘤患者中，FMT联合抗PD-1治疗克服了对抗PD-1的耐药性。尽管这些初步发现需要在更大的随机临床试验中进行进一步的评估，但在对抗PD-1治疗原发难治性的黑色素瘤患者中，观察到的ORR优于报道的ORR。治疗相关不良事件( AEs )最小。尽管所有患者至少经历了一次AE，但大多为低级别(1级，72.9%；2级，20.0%)。内分泌AEs主要是甲状腺功能减退，发生在17.6%的患者中，可以很容易地用激素替代治疗。3级AEs发生在3例患者中:2例出现疲劳，排除并解决了潜在的内分泌问题，1例周围运动神经病变需要住院，静脉注射免疫球蛋白和糖皮质激素，在重新使用派姆单抗后没有进一步的后遗症。 

图1抗PD-1反应源FMT和派姆单抗治疗PD-1难治性黑色素瘤的2期研究的放射学反应

粪菌移植可引起受者肠道微生物群的持续扰动  

为了评价FMT对受者肠道菌群组成的影响及其与临床反应（根据RECIST 1.1标准，定义为FMT和抗PD-1治疗后OR或SD＞12个月）的关系，研究者对从受者(n=15)和供者(n=7)获得的223份粪便样本进行了猎枪宏基因组测序。对每个受体的1份FMT前样本(在FMT前7 ~ 21天获得)和所有可用的FMT后样本(只要患者尚在试验中，前12周每周取一次样本，之后每3周取一次)进行测序(图2A )。对每个从特定FMT供体获得的供体特异性“FMT灌注液”进行测序。统一流形近似和投影(UMAP)分析描绘了受者(图2A)和供者不同的肠道微生物群组成。FMT后，接受来自具有CR或PR抗PD-1的供体输液的患者的反应没有显著差异。CR供体的微生物群表现出更高的α多样性，但在FMT前，供体和受体之间没有显著差异。在受体中，Rs和无应答者(NRs)单次FMT后，肠道菌群组成发生了变化(图2A)，这种变化持续存在，除非出现显著干扰(例如，PT-18-0032在22天前和PT-18-0018在84天前使用抗生素)。值得注意的是，所有单独收集的个体供者产生的输注液彼此之间高度相似。为了评估供者和受者的个体内变异，研究者计算了所有受者和供者可用样本(仅包括至少三个样本)的所有时间点和所有分类群的样本方差(图2B)。FMT后，与供者相比，所有受者的方差显著增大(图2B)，尽管与NRs相比，Rs有更大的方差趋势。利用多维欧氏距离量化了受者中微生物群落的差异和变化率。具体来说，从每天的欧氏距离推断，在Rs上的穿越速度比NRs要高(图2C)。虽然这个参数没有达到统计学意义(可能是因为样本量有限)，欧氏距离仍然明显地将实现疾病控制的患者与未实现疾病控制的患者分开。

为了研究供体微生物植入的程度及其与患者长期反应的关系，研究者通过测量供体微生物组成与相应受者每个可用时间点之间的欧氏距离，来评估受体微生物群与供体微生物群的获得相似性，从预处理样本开始(图2D)。研究者观察到，在Rs中，肠道菌群组成显著地向供体菌群转移，而在NRs中则没有(图2D)。NR组(n=9) FMT植入具有明显的异质性，其中大约一半的受者的样本与相应的供者相似，另一半的样本与相应的供者不同(图2D，顶部)。相比之下，Rs (n=6)的肠道菌群则均匀地向供体样本移动(图2D，底部)。研究者还使用受体血清和供体粪便评估了供体细菌的体液免疫反应，并观察到FMT在Rs中诱导供体细菌特异性免疫球蛋白G (IgG)的程度高于NRs(图2E)，这表明移植细菌的成功移植和黏膜易位(已知可诱导抗共生细菌的IgG反应)可能优先发生在Rs中。

研究中禁止全身使用抗生素;然而，PT-18-0018发生软组织感染，需要抗生素治疗。在此期间，尽管按协议规定的时间间隔获得了粪便样本和成像，派姆单抗仍被保留。FMT后的初始微生物群向SD患者的供体微生物群转移。抗生素治疗后，宏基因组数据显示微生物群落组成发生了显著变化(Faecalibacterium prausnitzii、Alistipes spp.和Ruminococcaceae spp.消失)，这些变化与临床进展相关。在首次FMT后近1年进行了来自同一供体的第二次移植，导致了与持续SD相关的快速肠道定植。总的来说，尽管FMT后的成功定殖并不总是能使PD-1难治性黑色素瘤患者对抗PD-1重新敏感，但临床反应与FMT植入和供体微生物群特异性IgG反应有关。此外，使用抗生素后，FMT后微生物群落组成的变化会迅速受到干扰，从而使有益类群(如F. prausnitzii、Alistipes spp.和Ruminococcaceae spp.)减少，这与此前报道的使用抗生素对癌症患者抗PD-1的有害影响一致。

为了分析最常与FMT临床获益相关的细菌种类，研究者首先对Rs患者的FMT前后样本进行了统计分析，然后采用Fisher ' s方法进行Meta分析，以确定所有样本的共同特征(图2G)。一些与临床反应相关的细菌种类已被报道(长双歧杆菌, Colinsella aerofaciens, and F. prausnitzii)。在Rs中显著富集的类群大部分属于厚壁菌门(毛螺菌科和疣微菌科)和放线菌门(双歧杆菌科和科里杆菌科)，而在Rs中显著减少的类群大部分属于拟杆菌门。 

图2黑色素瘤患者FMT前后的微生物组分析

粪菌移植和抗PD-1在外周和瘤内调节免疫反应  

为了评价FMT和抗PD-1在治疗患者中的免疫作用，研究者分别对治疗前和治疗后采集的外周血单个核细胞(PBMCs)和肿瘤样本进行了多参数流式细胞术和单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析。在治疗前后的三个连续时间点对PBMCs进行无监督单细胞流式细胞术光谱分析(图3、A、B)。与NRs相比，Rs在治疗后(第42天)显示出更高的CD56+CD8+T细胞百分比，这代表了活化的CD8+T细胞具有更高的细胞溶解功能(图3B)。与CD8+T细胞相比，CD8+CD56+T细胞表达了高水平的TIGIT、CD57、2B4、OX40、ICOS、4-1BB、CD16、NKp46、NKp30、颗粒酶B、穿孔素和CD103。这些发现与先前关于免疫治疗(包括放射免疫治疗或PD-1阻滞)对癌症患者有反应的报告一致。在Rs中，与NRs相比，CD8+T细胞在这些时间点上调了TIGIT(第21天)、T-bet和LAG-3(第42天)，下调了CD27(第21天)(图3C)。与NRs相比，Rs显示naïve CD8+T细胞的百分比(第21天)较低，终末分化效应记忆CCR7−CD45RA+(TEMRA)细胞的百分比(第42天)较高(图3D)。这些观察结果表明，就像之前在对PD-1阻断有反应的癌症患者中所显示的那样，Rs的循环中的CD8+T细胞更容易被激活和分化。黏膜相关不变T细胞(MAIT)对细菌抗原和炎症细胞因子有应答，与NRs相比，Rs中颗粒酶B表达更多(第42天)，CD27表达更少(第42天)，表明其表型更分化(图3E)。研究者观察到治疗前后循环骨髓细胞亚群频率无显著差异。数据表明，FMT联合抗PD-1可激活Rs患者PBMCs中的CD56+CD8+T细胞，并增加CD8+T和MAIT细胞的激活。

CD45+细胞从用于scRNA-seq分析的肿瘤活检中获得的单细胞悬浮液中筛选。总共从17个肿瘤样本（治疗前(4个Rs和5个NRs)和治疗后(2个Rs和6个NRs)）中收集了64,340个细胞。经归一化和去除成批效应，将细胞聚集成26组。每个聚类通过基因表达谱手工标记，以识别10种不同的细胞类型(图3F)。研究者观察到，与治疗后的Rs相比，在CD45+细胞中，NRs的髓系细胞(p=0.026)和CD4+调节性T细胞(p=0.02)的频率较高，而其他簇则没有明显变化(图3G)。髓系细胞表达高水平的CXCL8[白细胞介素-8(IL-8)]和SPP1(骨桥蛋白)，与Rs相比，FMT后NRs的CXCL8和SPP1水平升高，表明以前的髓系基因特征与肿瘤进展相关(图3,H和I)。治疗后，与NRs相比，Rs中CD8+T细胞上调了人类白细胞抗原(HLA) II类基因CD74和GZMK，支持肿瘤部位T细胞激活增加(图3I，左)。总之，本研究结果表明，FMT和抗PD-1可以抵消骨髓诱导的免疫抑制，从而增加Rs肿瘤微环境中CD8+T细胞的活化。但没有足够的肿瘤组织用于评估肿瘤突变负荷、PD-L1表达和干扰素-g (IFN-g)基因表达特征在预测临床结果中的作用。

图3循环和肿瘤浸润免疫细胞的单细胞分析

粪菌移植改变应答者的血清代谢组和细胞因子  

为了评估FMT对宿主系统参数的影响及其与治疗反应的关系，研究者对血清样本进行了多组学分析，包括血清细胞因子和趋化因子分析，以及血清代谢组学和脂质组学分析。虽然Rs和NRs的血清细胞因子和趋化因子组成相似，但Luminex多参数蛋白质组学分析显示Rs中循环细胞因子和趋化因子水平发生了显著变化，而NRs几乎没有或没有变化[图4A，主成分分析(PCA)]。Rs患者FMT后多种循环细胞因子和趋化因子下降，包括CCL2(MCP1)、CXCL8(IL-8)和IL-18,IL-12p70和IFN-g(图4A，热图)，IL-18与抗PD-1的不良结果相关。后两种细胞因子通常与抗肿瘤效应T细胞反应有关。然而，IL-12-IFN-g轴的慢性激活，可能发生在使用抗PD-1治疗的难治性患者中，可能会在肿瘤细胞中诱导多基因耐药性程序，并可能通过一氧化氮的产生和TCF1的下调破坏T细胞的免疫反应、分化和衰竭。最正常上调的细胞因子和趋化因子与在三级淋巴结构中发现的卵泡辅助T和B细胞特征相关，如IL-21和CXCL13(BCP1)。研究者还观察到II型细胞因子如IL-5、IL-13和IL-10;肿瘤坏死因子(TNF)细胞因子家族，如TNF和TRAIL;以及促进单核细胞迁移(CX3CL1)和树突状细胞扩增(FLT3L)的细胞因子的上调。总之，本研究结果表明，Rs下调了与抗PD-1耐药相关的多种循环细胞因子和趋化因子，同时上调了与良好临床结果相关的循环生物标志物。特别的是，Rs在肿瘤中表现出循环中IL-8和产生IL-8的髓系细胞频率的降低。IL-8是一种由瘤内和循环髓系细胞分泌的免疫抑制细胞因子，在包括黑色素瘤在内的多种癌症中，IL-8的水平与抗PD-1的不良预后相关。

FMT和抗PD-1导致Rs和NRs的血清代谢组学谱发生显著变化(图4B)，尽管最显著的代谢组学变化发生在Rs(图4B, PCA图)。FMT之后最显著和明显的变化是影响了通常与肠道微生物群相关的代谢产物。FMT后血清胆汁酸增加，与NRs相比，Rs的一级胆汁酸向二级胆汁酸转化更有效。此外，细菌通过苯甲酸盐降解芳香族化合物的分解产物水平在Rs中高于NRs。其中一些化合物，包括马尿酸盐、对甲酚硫酸盐和肉桂酸盐，已经被描述为微生物多样性的生物标记物，并与抗PD-1反应相关的类群的存在相关。尽管在FMT前来自Rs和NRs的样品具有非常相似的脂质组谱，但在FMT后来自Rs而不是NRs的样品中观察到显著的变化(图4C)，包括更高水平的三酰基甘油和更低水平的单酰基甘油和二酰基甘油，这可能反映了微生物组控制的脂质吸收差异。

肠道微生物群调节在反应者中观察到的生物特征  

为了确定独立于特定群体或患者的宿主与微生物之间的因果关系，研究者使用不同类型的组学数据创建了一个不同参与者之间稳健交互的统计模型——“转换网络”分析。转换网络由371个节点和819条边组成，其中节点代表组数据集的单个元素(宏基因组、代谢组、脂质组、流式细胞术和蛋白质组)，而边代表这些元素之间的正和负相关性(图4D)。大多数组间边缘属于微生物宏基因组数据集，该数据集与代谢组和蛋白质组数据集具有大量的正(红色)和负(蓝色)网络连接。与其他任何节点相比，微生物节点与其他组学数据集的连接更为紧密，这表明它们在FMT和抗PD-1后调控组间变化方面发挥着核心作用。转换网络分析中的一些节点高度互联，形成子网。通过使用Cytoscape的MCODE插件识别这些子网，一个子网连接所有4个组学数据集(图4E)。特别是，肠道细菌共生体对PD-1的反应增加(F. prausnitzii和Akkermansia muciniphila)和减少(拟杆菌属)分别与CXCL8 (IL-8)呈负相关和正相关。

图4 FMT前后的血清蛋白质组学、代谢组学和脂质组学特征

“论肿道麻”述评

在小鼠中，肠道微生物群调节抗PD-1的治疗活性，给予一定的FMT 可改善黑色素瘤小鼠抗PD-1的疗效。尽管在不同的研究中报道了不同菌种之间的一致性有限，包括双歧杆菌科、革杆菌科、厚壁菌科、和钩端螺旋菌科在内的各种关键细菌在黑色素瘤患者中对针对PD-1的单克隆抗体有良好的反应。 作者的研究结果 表明 在结肠镜下使用单次 FMT与PD-1阻断剂一起，成功地定植了Rs的肠道， 并重新编程了肿瘤微环境，以克服晚期黑色素瘤 某子集 患者对抗PD-1的原发耐药。 在 PD -1难治性黑色素瘤患者中，FMT将微生物群组成向有利于抗 PD -1疗效的分类群转移，以诱导对抗 PD -1的临床反应，这些患者具有对治疗产生反应的免疫能力，但其微生物群组成不利。 相反，PD-1耐药的患者可能由于各种原因对FMT 没有 反应，包括( 1 )由于患者的免疫缺陷状态或缺乏肿瘤免疫原性，无法对肿瘤做出反应，( 2 ) FMT缺乏抗PD-1治疗有效所需的类群，( 3 ) FMT未能成功植入受体并诱导 宿主微生物群有利于抗 PD -1 。除此之外，作者的研究亦存在一定的缺陷，其研究结果需要在更大规模的临床试验中进行进一步的研究，以更好地识别微生物、循环和肿瘤内的生物标记物，以选择最有可能从基于微生物群的黑色素瘤治疗中受益的患者。随着研究的不断进展，期望这些研究最终可以 发现一种细菌群 ，能够将 一组对抗 PD-1治疗原发难治性的黑色素瘤患者转化为R型患者。

编译：罗露；述评：刘毅

审校：张军，缪长虹 

参考文献：   Fecal microbiota transplant overcomes resistance to anti–PD-1 therapy in melanoma patients. Davar D , Dzutsev AK, McCulloch JA, et al.   Science   . 2021 Feb;371(6529):595-602. doi:   10.1126/science.abf3363. Epub 2021Feb5   .    

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