为环状RNA研究添利器：杨力团队用碱基编辑实现环状RNA特异性敲除

2022

01/25

生物世界

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环状RNA（circRNA），是一类非编码RNA，其特征在于3'和5'末端通过反向剪接形成共价连接。

撰文 | 王聪

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

环状RNA（circRNA），是一类非编码RNA，其特征在于3'和5'末端通过反向剪接形成共价连接。circRNA长期以来一直被认为是mRNA剪接过程的副产物，没有特定功能。

近年来，随着高通量测序技术的进步和广泛应用，人们在真菌、原生生物、植物、动物以及人类细胞中发现了许多circRNA。越来越多的研究表明，circRNA并非mRNA剪接的副产物，而是在细胞中发挥重要作用的一类RNA分子。

环状RNA通常是由编码蛋白基因的前体mRNA的外显子通过反向剪接而产生的，因此与其线性mRNA存在许多序列重复，这就导致缺乏特异性敲除环状RNA的方法。这大大限制了对环状RNA功能和产生及加工机制的研究。

近日，中科院上海营养与健康研究所杨力团队在 Genome Biology 期刊发表了题为：Knockout of circRNAs by base editing back-splice sites of circularized exons 的研究论文【1】。

该研究使用碱基编辑器（Base Editor）编辑环化外显子的反向剪接位点，实现对环状RNA的特异性敲除，而不影响其宿主基因和同源线性mRNA。

目前已经发现的环状RNA数以十万计，但深入研究过功能的却极少，其中一大原因是缺少研究其功能的方法，例如CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过在基因组水平敲除基因，从而探索特定基因的功能。但这种方法在环状RNA上往往行不通，往往会导致环状RNA的宿主基因和同源线性mRNA的改变。此外，还有研究使用CRISPR-Cas9破坏外显子侧翼互补元件从而抑制环状RNA的生成，但这种方法也只对少数简单的环状RNA可行。

2020年12月7日，陈玲玲、杨力、李劲松团队合作在 Nature Methods 期刊发表论文【2】，开发了CRISPR–RfxCas13d，通过gRNA靶向环状RNA的反向剪接位点，可有效区分环状RNA与线性mRNA，实现快速筛选和发现功能性环状RNA。

但这种基于Cas13d的方法，只能在RNA水平降低环状RNA表达，无法在基因组水平敲除环状RNA。

在这篇 Genome Biology 论文中，杨力团队使用碱基编辑器（Base Editor）进行环状RNA的特异性敲除。为了实现只敲除环状RNA而不影响其同源线性mRNA，研究团队找到只在环状RNA中存在的外显子反向剪接位点，并对它们进行碱基编辑。

通过这种方法，研究团队在293FT细胞中筛选到了一个新型环状RNA——circZNF292-nov，这个环状RNA来自ZFN292基因，包含外显子2、3、4，以及一个新的只在circZNF292-nov中存在的外显子。并进一步证实了该环状RNA对细胞生长具有抑制作用。

功能缺失（敲除或敲低）和功能增益（过表达）是研究基因功能的重要手段，但由于环状RNA与其同源线性mRNA存在大量相同序列，导致敲除或敲低很难不影响到其同源线性RNA。此外，环状RNA不编码蛋白，而是通过序列发挥调控作用，这也导致其不能像编码基因一样通过移码突变来造成其功能缺失。这就导致了大量的环状RNA的功能研究受到障碍。

这项研究不仅首次在基因组水平证实了环状RNA及其同源线性mRNA在共用剪接位点的竞争，也建立了利用碱基编辑器（Base Editor）对环状RNA进行敲除和功能研究的新方法。

论文链接：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-021-02563-0

https://www.nature.com/articles/s41592-020-01011-4