航海探险期间人类肠道微生物组动力学与 亚健康症状间的相互作用

编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

肠道菌群与人类免疫系统相互作用，在人类身心健康中起着关键作用。先前的研究表明，长期生活在一个封闭或半封闭的环境中，会深刻影响肠道菌群。虽然在远洋航行中对船员的健康管理给予了很大的关注，但关于人类与微生物群相互作用的研究仍然有限。有研究发现，航行后口腔微生物多样性会发生显著变化；此外，补充益生菌可以在一个月的海上航行中维持船员肠道菌群的稳态。然而，以下问题仍未得到解答:

（1）肠道菌群对远洋航行（即5个月以上的远洋航行）船员的健康有何影响；

（2）在远洋航行中出现“亚健康症状”的船员肠道微生物动力学如何?

本研究利用粪便样本的宏基因组测序和航行前后的健康问卷，探讨77名远洋船员在135天远洋航行期间肠道菌群与健康状况的关系，发现在众多“亚健康”症状中，排便频率异常、失眠、睡眠浅、恶心、暴饮暴食等症状往往共同出现，因此将以上症状定义为“远洋综合症 (seafaring syndrome, SS) ”的核心症状。在航行过程中，船员肠道菌群的变化受SS而非某种单一症状的影响。最后，通过随机森林模型可在航行前以84.4%的准确率（AUC=0.91）预测SS的发生，并在另一个航行队列中得已验证（83.3%准确率）。可以利用肠道菌群在出海前对海上作业人员的健康进行风险评估，甚至潜在成为船员筛选的参考。

论文ID

原名：Interactions between Human Gut Microbiome Dynamics and Sub-Optimal Health Symptoms during Seafaring Expeditions

译名：航海探险期间人类肠道微生物组动力学与“亚健康症状”的相互作用

期刊：Microbiology Spectrum

IF：7.171

发表时间：2022.1.12

通讯作者：孙志宏

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1128/spectrum.00925-21

实验设计

本实验由77名船员参与，为期135天。在航行开始和结束时采集粪便样本并收集问卷调查，根据问卷得分将受试者分为健康（1-2分）和有症状（3-5分）；依据类内离差平方和增量最小(Ward最小方差法)对所有船员的症状进行了聚类分析确定SS的核心症状。样本解冻后从每个样本中提取3个1.5 ml的细菌悬液（共4.5 ml）用Qiagen提取DNA，建库后使用Illumina HiSeq进行测序。使用mOTUs2和HUMAnN2进行物种分类和功能分析；Wilcoxon检验确定船员在两个时间点之间的微生物种类和基因功能的显著变化和各症状的Bray-Curtis或root Jensen-Shannon距离值，来确定症状和肠道菌群之间的联系；对期间丰度发生变化的微生物种类和功能进行鉴定和共现网络分析确定SS的微生物特征；并利用随机森林方法（RF）建立SS的预测模型。

图1 实验设计示意图

前言

海上航行中长时间的密闭/半密闭环境、高湿度、高盐度、强烈的紫外线辐射、水果和蔬菜不足以及缺乏体育锻炼等增加了船员健康状况不佳的风险。恶劣的生活和工作环境会导致船员出现一系列的生理和心理症状，这些症状是亚健康的表现，与心血管疾病、坏血病、口腔疾病、消化系统疾病、肌肉骨骼疾病、循环系统疾病等七种全身性疾病密切相关。此外，脱离家庭、活动空间有限、饮食不良等关键因素是导致精神压力的主要原因。在探险期间，科学家和工作人员可能会经历心理压力和主观疲劳，这与海洋环境显著相关。

系统性和慢性疾病是当今重要的健康问题，并已被证明与肠道菌群失调密切相关。研究极端环境（如海洋航行）中人类肠道菌群与亚健康状态之间的关系，将使我们更好地理解健康与肠道菌群稳定与失调状态之间的相互作用。在这次为期135天的海上考察中，使用粪便样本宏基因组学和航行前后的健康问卷，对77名船员的健康状况进行了评估。发现77名船员中有55人有5个核心症状（如排便频率异常、失眠、睡眠质量差、恶心和暴饮暴食），在这项研究中被称为“远洋综合征”（SS）。

研究表明，由于个体差异，不同的船员群体在远洋航行时会出现不同的症状；然而，高流行症状的共同发生表明肠道菌群的广泛扰乱。通过研究微生物特征和肠道菌群动力学，证明了这种健康状况甚至可以在航行前就被预测出来。本研究不仅为极端环境下的健康管理提供了潜在的策略，而且有助于预测其他与生态失调相关的疾病，并为生物失调相关疾病的潜在预测因子甚至治疗靶点提供见解。

实验结果

1 135天的远洋航行后的身体和心理症状调查

在航行开始（第1天）和结束（第135天）使用问卷调查了远洋航行期间的主要症状。为了避免年龄、性别和国籍等潜在的混杂因素，只分析了占主导地位的船员群体的数据（男性、汉族、中国；20至35岁）。问卷由三部分组成（方法）:（1）身体指标，（2）心理指标，（3）排便相关指标。

在身体症状方面（图2a），船员中发病率最高的是背痛（46.8%）和头痛（44.2%），与基线值（分别为6.5和5.2%）相比分别增加了40.3%和39.0%。其次是肌肉酸痛（35.1%）和胃痛（33.8%），分别比基线（7.8和3.9%）高27.3%和29.9%。所有船员的体重指数（BMI）在航行中没有显著差异。

船员存在严重心理问题（图2b）。睡眠质量差（77.9%）和失眠（66.2%）最为明显，而在航行前很少有睡眠问题。超过一半的船员经历过暴饮暴食（55.8%）、不活动（55.8%）和恶心（50.7%），分别比航行前增加了46.8%、44.2%和48.1%。这些症状表明远洋航行造成了高度的精神压力。

排便的变化是大多数船员的常见症状（图2c）。超过一半（53.3%）的船员排便频率（每周）异常，而基线（每周）时仅为1.3%。此外，42.9%的船员排便不完全（比基线增加了29.9%）和/或便秘（32.5%）没有导致排便（比基线增加了16.9%）。

图2 航海中出现的亚健康症状。身体（a）、心理（b）和与排便有关（c）症状的自我评估指标的变化。每个圆的左半部分表示旅行前的症状发生率，右半部分表示135天航行后的症状发生率。（原文图1）

  2 航海综合症的定义

虽然船员所忍受的极端生活和工作环境非常相似，但不同的个体经历了不同的症状。为了探讨症状之间的相关性，对船员在航行过程中生理、心理和排便指标的变化进行了聚类分析（图3d和e，方法）。根据这些症状，船员被分为四组：（1）A组：排便频率异常（每周）、失眠、睡眠质量差、恶心、暴饮暴食；（2）B组：除A组症状外，少数出现胃痛、头痛、排便不尽感、背痛、自责等症状；（3）C组：除A组的症状外，部分还出现了食欲不振、粪便类型异常（如水样粪便）、大便带血、排便困难、便秘（不排便）、肌肉酸痛、疲劳导致缺乏运动、抑郁、心悸、胸闷和不信任；（4）D组：仅出现孤独和呼吸困难症状的船员（即不包括A组至C组症状）。我们认为A组症状的共同出现（如排便频率异常、失眠、睡眠质量差、恶心和暴饮暴食）是远洋航行船员健康状况不佳的核心特征，称之为“航海综合症”（SS）。除了核心症状（几乎每个SS船员都患有核心症状）外，SS船员也容易出现B组和C组的症状（图3e）。

图3 航海综合症的特点。（d） 热图显示通过聚类单个结果调整的不同健康指标（症状）的变化。红色方块表示航行后发病率增加的症状，黄色方块表示没有变化的症状，蓝色方块表示航行后发病率下降的症状）。将症状分为4组，其中A组为SS代表症状的核心组。（e）聚集在橙色区域的船员代表患有SS的个体，而浅绿色区域代表没有SS的“无症状”个体。SS组和非SS组的症状发生率比较按组（A组到D组）聚类。（原文图1）

  3 肠道菌群与SS的关系

为了探讨SS与肠道菌群之间的关系，收集了粪便样本，并在两个时间点，即第1天和第135天进行了WMS（方法）。首先，为了确定SS对船员肠道菌群的影响大小，进行了Permanova检验。发现SS作为一个因子对肠道菌群的影响是显著的（表1B-D：F= 1.946，P=0.020；root Janson-Shannon距离[rJSD]：F=1.810，P=0.024），其显著性大于时间点的影响（Bray-Curtis相异度[BCD]：F=1.762，P=0.043；rJSD：F=1.481，P=0.063）。根据Permanova检验，任何症状的效应量都不显著（表1），表明在航行过程中，任何单一症状对肠道菌群的影响都很微弱。这些结果表明，船员的肠道菌群与一组症状相关（即SS，而不是任何单一症状）（表1）。

其次，为了研究个体在航行过程中的扰动，比较了患有SS的船员（聚集在A组的个体，图3d）和非SS的船员（没有聚集在A组的船员，图3d）的肠道菌群的扰动（微生物动力学变化）。虽然在第1天和第135天之间，肠道微生物组的alpha多样性（Shannon指数，Wilcoxon秩和检验，P=0.73）和PCoA聚类（图4a）无显著差异，但这两个时间点间的双重扰动（由BCD和rJSD表示）显示肠道菌群发生了显著变化（图4b）。SS样本中两个时间点之间的差异显著高于非SS样本（Wilcoxon秩和检验，BCD：P=0.024；rJSD：P=0.021，图4c）。然而，这种相关性在肠道菌群和任何单一症状之间都没有发现。例如，船员按症状（如睡眠质量差与无症状）进行分组，并对个体扰动进行相应的分组和比较，没有观察到任何单一症状的显著差异（图S1，方法）。

表1 以不同的生理和心理健康指标（症状）为因子对肠道菌群的Permanova检验。

图4 航行对肠道微生物多样性的影响。（a）基于两个时间点之间的分类（mOTUs2产生的微生物物种分布）和功能（HUMAnN2产生的宏基因组功能）剖面的主坐标分析。航次中每个个体的发展轨迹用灰线连接。（b）比较航次开始和结束时个体间的BCD和rJSD，以及两个时间点个体间的距离。（c）基于BCD和rJSD（BCD: P=0.024，rJSD: P=0.021）的SS组和非SS组肠道菌群个体扰动的箱线图。（原文图2）

  4 航行中SS的微生物特征

为了确定促进SS发展的微生物生物标志物，比较了SS组（由A组症状定义）和非SS组从航行开始到结束的微生物种类和功能的丰度（图5a；方法）。结果显示，与非SS组相比，SS组有15个物种在航行中显著增加（Wilcoxon秩和检验，P＜0.05），4个物种显著减少。12条通路的25个基因家族的丰度在航行中比非SS组少，而SS组的有一个基因家族的丰度增加。这表明，在航行中可以在SS船员中捕获微生物特征，能用19个分类和26个功能生物标志物进行量化。对以往的慢性疾病微生物群落研究中发现的19个差异种进行搜索，其中17个种的变化与慢性疾病的结局或发展相协调，表明SS与慢性疾病之间存在相关性（表2）。

为了更好地了解SS组与非SS组之间的微生物动力学差异，对航行前后的粪便样本进行了共现网络分析（图S2，表S1，方法）。使用以下阈值来比较四个共现网络的节点、边缘和密度（图5b）：相对丰度大于0.001，患病率大于10%，P=0.01。基于共现网络模式（节点和边）和性质（密度），发现非SS和SS具有独特的微生物动力学特征，两组的微生物种类相关性甚至在航行开始时就不同。

表2 有症状和无症状船员与慢性疾病之间差异丰富类群的关联。

 图5 航海综合症的微生物特征。（a）航行期间大量变化的微生物种类和功能的条形图（绿色代表航行后增加的种类/功能，红色代表航行后减少的种类/功能）。（b）四个共现网络节点（左面板）和边（右面板）的维恩图:航次开始（第1天）和结束（第135天）的SS和非SS。（原文图3）

  5 航行前SS预测

为了探究SS是否可以被预测，利用随机森林（RF）模型，基于航行前采集的样本的微生物分类和功能图谱，建立了SS组和非SS组的预测模型。将最具鉴别性的前28个品种（基于RF评估的重要性）模型和功能纳入后，性能改善很小（表S2；图6a）。最终，SS样品可以与非SS样品区分，准确率为84.4%（浓度-时间曲线下10倍交叉验证面积[AUC]=0.91，图6b）。尽管使用微生物种类或函数基线数据的RF模型具有相当的性能（准确性=80.5%，AUC=0.84；准确率=83.1%，AUC=0.84），但基于问卷回答的RF模型只能预测SS的发病，准确率为68.8%（AUC=0.69）（图6b）。因此，仅来自基线肠道微生物组数据的生物标志物就可以潜在地预测SS发展的可能性，不需要确定生理或心理状态。

为了验证SS预测模型，采用了Zhang等人的另一个相关队列，其中设计了一项为期30天的纵向研究，旨在探索航海对肠道微生物的影响和益生菌是否是保护肠道健康的可行方法。根据混合益生菌产品（含乳酸菌和双歧杆菌）的供应，将船员分为对照组（未服用益生菌）和益生菌组（服用益生菌）。利用航行前的微生物组数据对56名船员进行SS预测，并将预测结果与SS结果进行比较（图6c和d）。发现对照组中有6名被预测为SS，18名被预测为健康，预测准确率为83.3% （AUC = 0.81）。

 图6 随机森林模型预测船员航海综合症的可能性。（a）根据肠道菌群选择RF模型的生物标记物，以预测航海综合症的发展可能性。x轴为RF模型中使用的特征（物种）数，y轴为交叉验证的错误率。分析了RF模型中变量个数与模型性能之间的关系；筛选出28个最具鉴别力的生物标志物。（b）基线时使用不同生物标记的RF模型的预测性能（例如，仅微生物物种、仅微生物功能、仅在航行前进行问卷调查，以及微生物物种加基因功能），通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）进行评估。（c）使用第1天的微生物组数据得出的SS预测结果与航行结束时通过问卷调查得出的SS实际结果进行比较。（d）30天航行中对照组和益生菌组的SS预测模型的性能。（原文图4）

讨论

调查问卷清楚地表明，船员在远洋航行后的健康状况并不理想。然而，由于个体对相同的刺激和/或环境的反应可能不同，因此单独出现的任何症状都不能与肠道菌群呈正相关。这使我们认为肠道菌群的类似变化可能会引发不同的生理和心理反应。为了验证这一假设并排除个体差异带来的干扰，首先对症状进行了聚类分析，这在以往的研究中由于样本量的限制和问卷设计的原因很少进行。首先确定了排便频率异常、失眠、睡眠质量差、恶心和暴饮暴食（A组的症状）等症状的共同出现，描述了大多数船员（即那些被确定为“远洋综合征（SS）”的人）的亚健康状况，并证实了SS与肠道菌群之间的密切联系。之后发现了SS的一种微生物特征，支持了肠道菌群的类似变化既可以触发相似的（如A组的症状），也可以触发不同的生理/心理反应（如B组的症状或C组的症状）这一假设。

此外，为了将SS的概念应用于船员对极端环境反应的实时预测，建立了一个可以预测SS可能性的模型。该模型在航行前对SS的预测精度为84.4% （AUC=0.91），这将是一个有益于船员健康风险评估和海上航行远洋航行中个体选择的潜在标准。此外，通过对30天航行队列的验证，比较益生菌对船员健康状况的影响，进一步证明了模型的有效性。我们发现益生菌干预船员模型的准确性降低，表明益生菌有预防或减轻SS的潜力。研究极端环境下肠道微生物与亚健康状况之间的关系，将使我们更好地理解肠道菌群健康和生态失调之间的相互作用，这可能与系统性或慢性疾病有关，是当今社会的一个重要健康问题（慢性疾病导致约4100万人（71%）死亡）。本研究为发现极端环境引起的亚健康状态的潜在微生物和细菌基因功能预测因子提供了基础，并展示了如何预处理症状可缓解个体特有的多症状生物失调。我们计划在航海中引入一些益生菌作为干预，如干酪乳酪杆菌Zhang，植物乳杆菌P-8，乳双歧杆菌V9，鼠李糖乳杆菌Probio-M9，和乳双歧杆菌Probio-M8，并在下一步工作中挖掘亚健康与肠道微生物群之间的相互作用。

结论

本研究评估了远洋航行船员肠道菌群与健康状况之间的关系，确定了SS的核心症状；船员肠道菌群受到SS的影响的原因是航行中肠道菌群个体扰动；确定了促进SS发展的微生物生物标志物；SS和非SS之间的微生物动力学是不同的；本研究还验证了一个基于SS微生物特征的高精度模型，以预测航海前SS的可能性。本研究不仅为极端环境下的健康管理提供了潜在策略，而且有助于预测其他与生态失调相关的疾病，利用肠道菌群在出海前对海上作业人员的健康进行风险评估，甚至潜在成为船员筛选的参考。

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