科研 | New Phytologist：土壤盐渍化在植物性能的迭代选择中加速微生物群的稳定

导读  

       与气候变化相关的土壤盐碱化增加了植物的压力，降低了生产力。土壤微生物被认为可以通过多种机制减少盐胁迫，因此不同的组合可以改善植物在盐碱条件下的生长。前人研究表明，微生物组选择可以促进所需的植物表型，但具有高度的变异性。我们假设，通过增加对植物的潜在益处，盐渍土中的微生物组选择将更加一致。

       在盐改性土壤和未处理土壤中，我们将芜菁（Brassica rapa）根系微生物群（来自高生物量或随机选择的盆栽）转移到6个种植世代，同时评估详细介绍了细菌（16S rRNA）和真菌（ITS）的组成。不同的是，我们加入了一个加回控制（重新添加初始冻土微生物组），作为微生物组和植物表型选择的代内参考。

       我们观察到不同世代的微生物组选择对植物生物量的影响不一致，但微生物组成始终与加回控制不同。尽管盐的添加对微生物的组成有很大影响，但它并没有增加微生物对植物表型影响的可预测性，但确实增加了微生物组选择稳定的速率。

这些数据突出了微生物组选择过程中微生物组轨迹和植物表型的脱节，强调了标准对照在解释微生物组选择结果中的作用。

论文ID

原名：Soil salinization accelerates microbiome stabilization in iterative selections for plant performance

译名：土壤盐渍化在植物性能的迭代选择中加速微生物群的稳定

期刊：New Phytologist

IF：10.151

发表时间：2021.10.6

通讯作者：Terrence H. Bell

通讯作者单位：美国宾夕法尼亚州立大学，康奈尔大学

DOI号：10.1111/nph.17774

实验设计

前言

       全球气候变化正在加剧环境扰动的严重程度和频率。除了气温上升，气候变化还通过海洋酸化和土壤盐碱化等过程重塑栖息地空间，威胁生物多样性和生态系统功能。气候驱动的土壤盐渍化是由降雨模式改变、降水速率和海平面上升等因素共同导致的，是自然系统和农业系统面临的一个主要问题，并加剧了土地集约使用 (例如灌溉用水和地下水位) 带来的盐渍化问题。盐胁迫显著损害植物生理和发育，但土壤微生物被认为能够减轻土壤盐分对植物的一些负面影响。植物在压力条件下可以改变甚至增加根系分泌物和根沉积物，这可能会使它们在盐存在的情况下影响有益根际微生物的招募。尽管各种微生物都参与支持植物在盐水条件下的生长，尚不清楚任何一个分类单元是否会产生关键影响。相反，微生物被认为可以通过多种机制促进盐渍化土壤中植物的生长，包括养分溶解、乙烯还原和胞外多糖的合成。因此，植物的生长促进可能是由于土壤微生物群中许多类群的累积贡献。

       包括盐保护在内，许多关键的生态系统服务如养分保持、植物养分获取和植物病原防御等在很大程度上或部分上都是由土壤微生物提供的。在农业环境中，有效的微生物管理可能会增加微生物对这些过程的贡献，比如减少对化肥和农药的需求，因为化肥和农药会对人类健康、环境和植物微生物关系产生负面影响。用于农业植物的微生物产品已经存在了一个多世纪，但是最近利用微生物组移植治疗人类疾病方面也取得了成功。许多农业生物技术公司在开发促进植物生长的微生物产品方面投入了巨额资金。

       一些现有的微生物产物，如菌根真菌和根瘤菌，与植物形成了重要的一对一的相互作用，并可能对植物性状产生重大影响。然而，选择复杂的促生微生物组可能会提供额外的好处，因为可以获得具有多种功能的微生物【例如固氮 (N2) 和溶磷 (P) 】，在给定的土壤/根系系统的不同微环境中 (如低pH和高pH微位点内) 发挥相似的功能，获取不同的资源 (如代谢不同类型的土壤碳 (C) ，或协同执行植物促生功能。此外，微生物组合在组合进化时的功能不同于单独进化时的功能，这使得仅根据存在的类群来预测微生物间的相互作用和微生物组在土壤中的表型变得困难。因此，根据植物表型 (或其他可观察的类群性状) 选择有益的土壤微生物组合是一个很有吸引力的概念。

       在传统的植物育种中，即使不深入了解植物的基因组成，基于表型的渐进选择也可以增强所需的性状。然而，植物表型引导的选择对微生物组组成和功能属性的遗传力可能是完全不同的，因为选择不是强加于单个个体，而是许多个体。前人研究表明，微生物组特征的定向选择是合理的，但过程是未知的。例如，在低CO2排放微生物组的选择确实导致了CO2的减少，但会出现大量反弹。选择目标植物表型 (如开花时间和生物量) 时的结果与之相似。这些研究显示了微生物组驱动的表型在选择世代间的详细变化，但这与世代间微生物组成的变化不匹配。因此，微生物组选择过程中的表型变异是否伴随着微生物组变异尚且未知，而微生物组变异是表型变化的预期驱动因素。尽管在微生物组选择过程中植物表型的变化往往很混乱，但我们预计增加土壤胁迫会增加植物对土壤微生物的依赖，从而导致更快速和稳定的表型选择。

       在本研究中，我们旨在研究加盐土壤和不加盐土壤中根系相关微生物组的渐进选择是如何影响植物表型的。我们在成熟芜青（Brassica rapa）生长32d后，将与根系相关的微生物组转移到新的灭菌土壤中，并选择稳定的种子库进行播种（对植物基因型未进行选择），这一过程重复了6代。我们选择了芜青作为本研究的对象，因为它曾在值前的微生物组选择研究中被使用过。并且我们对在加盐条件下种植芸薹属（Brassica）植物有重大兴趣。在先前的渐进式微生物组选择研究的基础上，我们将芜青的高生物量生产作为一个表型，这也是一个相关的农业性状。我们采用了3种选择处理：4个重复表型选择株系，其中微生物群落从最高生物量植株的根部转移; 在随机选择控制中，微生物组从随机选择的四个花盆中转移;而且，特别的是，本研究采用加回控制，即其中接种的微生物组始终是第1代土壤所使用的微生物组的解冻版本。本研究采用加盐和不加盐的选择来改变植物对土壤微生物的依赖，以减轻胁迫。研究假设微生物组的选择模式与植物生物量的选择模式平行，并且在盐干扰下的选择更稳定。

实验结果

1 植物性能不会随着时间推移持续改善

       至少在6个种植世代内，向后续种植世代转移高生物量微生物组并没有导致植物生物量的持续增加。一般而言，植物生物量的结果呈现随机性（图2；补充图S1和补充图S2）。在不加盐和加盐处理的G3、G4和G5以及G4和G5中，植物生物量相对于加回控制具有显著差异（补充表S1、S2和S3）。然而，这些生物量差异相对于加回控制既有增加也有减少。

图1. 微生物组选择的概念图。

 图2. 每代生物量相对于加回控制的变化。星号如下所示，表示总体比较的显著差异：***，P<0.001，**，P<0.01，*，P<0.05。系指表型选择系。每个点代表20个样本的平均值。

2 选择导致生物多样性减少

       一般而言，Shannon多样性（补充图S3）的差异是由均匀度差异驱动的（补充图S4和补充表S4）。总的来说，除了不加盐处理中的细菌组成外，随着种植世代的增加，物种多样性呈下降趋势。值得注意的是，加盐处理的细菌多样性低于不加盐处理（补充表S5）。加回控制的G5和G6中真菌多样性比其他所有组都高（补充表S6和S7）。

3 与植物生物量不同，微生物的组成在不同的世代中始终不同于加回控制

      单个处理的离散聚类分析显示，加盐与否对细菌和真菌的成分有显著影响（图3；补充表S8）。世代也与组成显著相关（补充表S8），微生物组成逐渐偏离G1中的组成（图3）。加盐与否解释了相对更多的细菌组成差异（R2=0.31），而不同世代的差异解释了更多的真菌组成差异（R2=0.29）。

图3. 细菌（16S rRNA基因）和真菌（ITS区域）组成随时间和加盐与否的PCoA分布。样品按世代划分颜色，形状与盐处理相对应。加回对照样本具有独特的形状（空心三角形表示无盐，星号表示盐），尽管选择系存在代际差异，所有的加回对照在G2以后聚集到了一起。G1土壤来自田间（包括加回对照）。

       根据不同世代来分析微生物组成时，除G1外，所有世代的微生物组成总体上都存在显著差异（补充表S9）。由于G1土壤来自田间，我们预计没有微生物组成差异，但在不加盐处理中，我们确实观察到了细菌组成的差异。随机选择对照品系和表型选择品系之间的差异主要表现在细菌组成而非真菌组成上。相反的，加回对照品系和个体表型选择品系之间的微生物组成没有显著差异（补充表S10和S11）。与随机选择对照品系和表型选择品系（G6中的R2平均值=0.34）相比，加回对照品系和表型选择品系之间的比较解释了更多的微生物组成差异（G6中的R2平均值=0.60），这可能表明微生物组成与加回对照品系之间存在差异。

       为了探索加回对照中微生物成分的可能差异，我们提取了加回对照与每代内所有选定品系的Bray Curtis差异（图4）。微生物组成在各代之间与加回对照的差异越来越大（补充表S12）。G6中，与细菌组成相比，真菌组成与相应的加回对照更不相似（图4）。真菌成分的不相似性随时间呈上升趋势，而细菌成分的不相似性最初呈上升趋势，然后趋于平稳（不加盐）或略有下降（加盐）。

图4. 与加回控制相关的微生物组成差异。每代提取加回对照品系和所选品系之间的Bray Curtis差异。数据用多项式曲线绘制。由于G1期的土壤来自田间，我们不希望这一代的差异性有所不同。P值：***=<0.001，**=<0.01，*=<0.05。

       为了确定哪些高等分类群导致了加回控制与表型选择系和随机选择控制之间的差异，我们绘制了高等分类群的线性轨迹（补充图S5、补充图S6和补充图S7）。一般来说，随着时间的推移，细菌门的相对丰度开始趋同，这可以解释细菌组成数据中Bray-Curtis差异性的平稳和下降。在不加盐处理中，Ascomycota中一种未分类纲的相对丰度不断偏离加回对照，反映了Bray-Curtis不相似真菌组成的差异模式（图4）。在加盐处理中，这种差异可以用前世代的Saccharomycetes和后世代的Sordariomycetes来解释。我们通过将表型选择系与加回对照比较，进行差异丰度测试，以确定由表型选择系（补充表S13、S14和S15）选择或筛选的OTU。不考虑盐的影响，我们鉴定了32个细菌OTU和10个真菌OTU，它们在通过表型选择系的连续选择方面呈现出显著阳性。相比之下，在连续选择过程中，17个细菌OTU和17个真菌OTU被显著过滤掉。盐改性处理的阳性选择微生物数量较多，有19个细菌OTU和7个真菌OTU，而在无盐处理中选择了13个细菌OTU和3个真菌OTU。我们观察到表型选择系和随机选择对照之间的OTU没有显著差异。此外，我们通过网络分析确定了与分组表型选择系显著一致的6个属（补充表S16）。有趣的是，第4代和第5代的相关性似乎与每个分类单元相反，这表明在这些世代中，植物过滤的作用可能更强。

讨论

       气候驱动的土壤盐碱化预计会加剧集中管理土地和自然条件下的现有盐碱化问题。在农业环境中，提高我们在高盐土壤中种植作物（如芸薹属Brassica植物）的能力以适应日益加剧的土壤盐碱化是一个重大的课题。微生物对耐盐性的贡献可能是由微生物组中许多分类群的附加贡献驱动的。选择耐盐功能的方法可能需要同时针对许多分类群及其相互作用的方法，这使得以改变微生物组功能为目标的微生物组操作成为农业中一个吸引人的概念。近期许多研究将微生物组成与植物表型特征联系起来，表明微生物组的人工选择可能能够以一种可预测的方式改变植物表型。经证明，这种方法会影响植物生物量、干旱胁迫恢复力和植物开花时间。然而，微生物组特征的人工选择是否随着时间的推移而稳定，或者微生物组成的轨迹是否与植物表型特征的变化平行，目前尚不清楚。关于在人为选择土壤微生物组时的代际变化只有零星报道。

在表型选择系和随机选择对照中，我们观察到加回对照的微生物组成一致且接近线性差异。微生物组成的差异可能是由优先在植物根和根际定殖的阳性、中性和有害微生物的连续选择所驱动的，与观察到的植物表型的差异选择相反。随机选择对照品系和表型选择品系（即差异丰度测试）之间的一些OUT的显著缺乏进一步突出表明，我们可能正在积累根际适生微生物。在加盐条件下，细菌的选择似乎比在不加盐条件下更快地趋于稳定（图4），这表明在加盐条件下，有效微生物的植物选择发生得更快。与此对应，差异丰度测试还确定了更多的OTU，这些OTU在加盐条件下被积极选择。盐胁迫也更多地解释了细菌组成相对于真菌组成的β多样性差异，表明土壤盐渍化在细菌过滤中起着更大的作用。

在我们的实验设计中，我们假定微生物组选择分为两个阶段，这两个阶段依次发生：

（i）对根际适应微生物的持续筛选，以及（ii）对特定表型的周期性正选择。盐碱条件下细菌更快速稳定的选择趋势（图4）表明，第1个选择阶段主要通过6代完成，也许更长的选择过程会导致更明显的表型选择。

       有趣的是，虽然土壤微生物组选择对植物性能有不同的影响，但我们观察到，在加盐或不加盐条件下，植物生物量与随机或目标微生物组选择之间没有明显的正相关，尽管某些世代中植物生物量高于加回控制。先前的研究表明，基于相反的表型（如早花与晚花）或选择条件（如低或高水分利用率）选择微生物组可以产生对植物生长影响不同的微生物组。我们的研究表明，至少在短期内，选择与高性能植物相关的微生物组和选择与随机选择的盆栽相关的微生物组之间没有明显差异。由于我们全面的微生物组取样，我们只关注前6代的选择，但通过微生物组选择观察到的植物性状的正向选择仅在3到5代之间。虽然我们假设表型选择在加盐处理中更加一致，但由于植物选择压力的增加，生物量的提高在两种盐处理中同样不一致。未来进行微生物组选择研究的一个考虑因素是土壤中初始接种物的选择。在我们的研究中，我们使用低盐土壤作为不处于明显的盐压下的中性接种源，以避免盐改处理中的微生物选择偏差。我们的目标是使接种物成为一个不被田间作物种植显著影响的多样化微生物“种子库”。然而，我们承认接种源对于选择过程中有益类群/功能的初始招募非常重要，并且将是未来研究的重要方向。

       与以前的研究不同的是，我们使用了6个复制表型选择系、1个随机选择对照和一个加回对照。加回对照的使用为微生物组组成和跨代植物表型变化提供了一个可靠的参考点，这优于先前涉及多个植物生长周期的选择实验的标准。即使在高度控制的生长室中，植物生长的均值也会在很大程度上受到湿度和气体浓度等因素的影响。不同代间加回控制（即将初始微生物组接种在G2之后的灭菌土壤）微生物组的明显聚类，表明冷冻和重新接种土壤是一种有效的复制土壤微生物组分的方法，甚至在冷冻之后8个月依旧可以有效复制（图3）。莴苣叶层的冷冻接种物微生物组组成的重建进一步支撑了这一观点。

结论

       近年来，为了提高植物适应性，人们对微生物管理和微生物组操作的兴趣稳步增加。本研究的数据表明，在选择的早期阶段，通过微生物组的转移来选择植物表型是不可预测的。尽管植物表型的轨迹不可预测，但我们观察到，微生物组成相对于加回控制存在近似线性的差异，这可能是由根际适应性微生物的积累所驱动的。微生物组成的这种巨大差异表明，无意识的微生物选择可能会在农业环境中迅速发生，特别是在重复种植相似基因型作物的田地中。根际微生物的组成在不同的植物类型中往往是独特的，因此一种特定作物根际适应性微生物的积累对微生物管理和轮作都有影响。研究盐碱条件下植物微生物的补充对于理解全球气候变化如何影响植物与微生物的关系至关重要。我们观察到，在盐碱条件下，植物对细菌组成的过滤能力比真菌更强。我们的数据表明，盐碱化可能会影响可供植物补充的细菌库，并可能进一步加剧农业环境中常见微生物功能的耗竭。