科研 | J GINSENG RES：高丽红参修饰乳杆菌对小鼠阿尔茨海默病的改善作用

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

背景：肠道菌群通过肠-脑轴影响中枢神经系统，其也会影响神经紊乱。阿尔茨海默病(AD)患者的肠道微生物群不同，是导致AD发展的潜在因素。口服红参可改善认知功能。因此，可以提出KRG影响肠-脑轴至大脑的微生物群。

方法：采用Tg2576小鼠作为AD的实验模型。随机分为野生型(n=6)、AD小鼠(n=6)、30 mg/kg/day AD小鼠(n=6)和100 mg/kg/day AD小鼠(n=6)。两周后，采用Illumina HiSeq4000平台进行16S基因测序，分析肠道微生物变化情况。通过定量Western blot分析Iba-1蛋白来评估小胶质细胞的激活情况。采用Claudin-5、occludin、层粘连蛋白和CD13检测血脑屏障(BBB)完整性。采用ELISA法检测β淀粉样蛋白(Aβ)积累情况(Aβ42/40比值)，采用新物体定位试验监测认知功能。

结果：KRG可改善小鼠的认知行为(30 mg/kg/day p＜0.05;100 mg/kg/day p＜0.01)， Aβ42/40比值降低(p＜0.01)，表明Aβ积累量减少。Iba-1增加(p＜0.001)导致小胶质细胞激活减少，Claudin-5上调导致血脑屏障通透性降低(p＜0.05)。特别是肠道微生物群多样性发生改变(30 mg/kg/day q＜0.05)，表明乳杆菌属(Lactobacillus)物种数量增加(30 mg/kg/day 411%；100 mg/kg/day 1040%)。

结论：KRG给药显示肠道微生物群中乳杆菌占优势。KRG对AD病理的改善作用可通过AD模型小鼠的肠-脑轴来实现。

图文摘要

论文ID

原名：Effect of Lactobacillus dominance modified by Korean Red Ginseng on the improvement of Alzheimer's disease in mice 

译名：高丽红参修饰乳杆菌对小鼠阿尔茨海默病的改善作用

期刊：Journal of Ginseng Research

IF：6.060

发表时间：2021.11.11

通讯作者：Manho Kim

通讯作者单位：韩国首尔大学医院生物医学研究所

DOI号：10.1016/j.jgr.2021.11.001

实验设计

前言

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是影响老年人的最严重的神经退行性疾病之一。非认知行为问题和认知障碍，如记忆、语言、空间感知或其他皮质功能障碍，是痴呆症的主要症状。通过对大脑分子和细胞水平的实验研究，已在一定程度上阐明了该病的发病机制。虽然已经进行了数百次临床试验，但目前还没有可用的药物疗法来完全防止疾病的进展。β淀粉样蛋白(Amyloid beta,Aβ)聚集及其信号级联被认为是神经毒性和小胶质细胞活化的主要原因。磷酸化tau蛋白或低聚物越来越多地被报道为AD发病机制发展的另一个主要因素。据报道，健康个体的肠道微生物群改变与多种疾病有关，如帕金森病(Parkinson's disease)、精神分裂症(schizophrenia)、1型糖尿病、高血压或白塞氏病(Behcet's disease)。此外，肠道微生物环境的破坏也在AD相关发病机制的发展中发挥作用。

肠道微生物群失调产生的代谢产物如短链脂肪酸(乙酸、丁酸、丙酸)导致血脑屏障(BBB)通透性增加，使代谢产物能够通过BBB。因此，肠道微生物群影响突触的发育、神经递质的控制或大脑中神经营养因子的释放。因此，恢复改变的肠道微生物群可能是调节AD的策略之一。

高丽红参(Korean Red Ginseng, KRG)对记忆力减退、炎症、癌症、心血管疾病等有多种疗效，而且没有严重的副作用。KRG对AD的作用被描述为大脑内的神经保护，需要从肠道微生物群的角度进一步探索摄入KRG对AD的影响。

在本研究中，我们在AD转基因小鼠模型中复制了KRG对AD的改善作用。根据微生物群的变化分析行为表现、血脑屏障通透性、Aβ积累、小胶质细胞激活等，以论证KRG通过肠脑轴调控AD的潜力。

结果

1 KRG对认知功能的改善

我们比较了四个实验组来分析KRG在AD小鼠模型中的作用：1.WT(野生型)；2.Tg2576-Control(未经KRG处理的转基因AD小鼠；3.Tg2576-ST(全称)30 mg/kg/天；4.Tg2576-ST 100 mg/kg/day(经KRG处理的转基因AD小鼠，给药剂量分别为30 mg/kg/day和100 mg/kg/day)。 使用新物体识别实验来测量记忆(图1A)。Tg2576-Control与WT组相比，对新物体的识别倾向较低。与未处理的转基因小鼠相比，KRG给药组小鼠的探索能力显著增加，表明其记忆能力增强(30 mg/kg/day p＜0.05; 100 mg/kg/day p＜ 0.01; 图 1B) 。  

图1 KRG对AD小鼠新物体识别试验的影响。(A)新物体识别测试方法。(B)小鼠探索目标区域所花费的时间。在熟悉阶段，14天的KRG给药对小鼠在a2区的进入次数和花费时间没有显著影响。在测试阶段，KRG给药显著减少了新目标区(b区)的进入次数和花费时间。与WT组相比，Tg-2576 Control新物体数量减少。与Tg2576 Control相比，KRG(30和100 mg/kg/day)给药增加了新物体的数量。结果表示为平均值±SD，n=6，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001与Tg2576-Control相比；*P＜0.05与Tg2576-ST 30 mg/kg/day相比；**P＜0.01与Tg2576-ST组为100 mg/kg/day相比。

2 通过摄入KRG减少Aβ积累

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)证实了通过摄入KRG减少Aβ积累而改善AD病理。Tg2576-Control的Aβ积累量高于WT组。KRG处理降低了Aβ42/Aβ40比值(Tg2576-ST 30 mg/kg/day p＜0.01; Tg2576-ST 100 mg/kg/day p＜0.01;图2A)。免疫荧光染色显示，Tg2576-Control有Aβ积累，而WT组没有Aβ积累。与ELISA结果不同，在本实验中，KRG不能区分Aβ积累的变化(图2B)。

 图2 KRG可降低AD小鼠模型的不溶性Aβ低聚物。(A) ELISA检测各组中可溶性Aβ40、Aβ42及Aβ42/Aβ40比值。采用单因素方差分析Turkey's post-hoc test评估统计学意义(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)。(B)各实验组海马区和皮层区6E10(红色)抗体染色的代表性图像。每组n=6，比例尺:100 μm。

3 减少小胶质细胞的激活

随着小胶质细胞的激活，Aβ积累导致神经元死亡，从而导致AD的进展。定量Western blot分析显示，与WT组相比，Tg2576中激活小胶质细胞的标记物Iba-1水平增加(p＜0.001)(图3)。Tg2576-ST 30 mg/kg/day的Iba-1蛋白水平与WT相当。

 图3 KRG对AD小鼠模型中Iba-1表达的影响。(A) Iba-1和β-actin的Western blot代表图。(B) Western blot检测全脑匀浆中的Iba-1水平。Iba-1水平用平均值±SEM表示，在同一凝胶中标准化为β-肌动蛋白水平。采用单因素方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验，确定各组间Iba-1表达水平的统计学差异。p＜0.001 Tg2576-ST 30 mg/kg/day，p＜0.001 Tg2576-ST 100 mg/kg/day。

4 血脑屏障通透性和KRG

Claudin-5是血脑屏障中的紧密连接蛋白，与AD等神经退行性疾病有关。免疫印迹（Western blot）分析显示，Tg2576-Control组的Claudin-5表达水平低于WT组(P＜0.01)。KRG诱导Claudin-5表达上调(P＜0.05)(图4)。免疫组化(IHC)分析也显示KRG的摄入增加了Claudin-5的表达(图4B)。 结合蛋白Occludin在Tg2576-Control的表达低于WT组(P＜0.01)。免疫组化显示Occludin的免疫反应性因摄入KRG而增强(图4B)。 由于层粘连蛋白在调节BBB血管完整性中的作用，也对其进行了评估。免疫组化分析显示，与WT组相比，Tg2576-Control层粘连蛋白表达较低。Tg2576-ST 30 mg/kg/day组，层粘连蛋白表达增加(图4C)。 CD13是与血管形成相关的蛋白，Tg2576-Control组的CD13表达也低于WT组。但经KRG给药后，其表达无明显变化(图4C)。  

图4 KRG对AD模型小鼠内皮细胞Occludin、Claudin-5、层粘连蛋白和CD13表达的影响。(A)各实验组小鼠脑实质蛋白提取物免疫印迹分析。Occludin和Claudin-5的水平用平均值±SEM表示，在同一凝胶中标准化为β-肌动蛋白水平。采用单因素方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验，确定各组间Claudin-5表达水平的统计学差异。*p＜0.05 Tg2576-ST 30 mg/kg/day。Tg2576-ST 30 mg/kg/day组与Tg2576-ST Control相比，内皮细胞Claudin-5数量增加，且具有形态学特征。(B)各实验组脑组织紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-5)的代表性图像。(C)各组小鼠大脑皮层中CD13(红色)周细胞覆盖的代表性图像。层粘连蛋白(红色)被用作内皮细胞标志物。演示数据是三个实验的代表性案例，每个实验每个条件下有六只小鼠，从单个动物获得。(比例尺:100 μm)。

5 KRG对肠道微生物群的影响

用16S基因测序法观察微生物群变化(图5)。Tg2576-Control的属水平多样性与WT不同，与WT相比其多样性更少(图5A、图S1、图S2)。WT组与Tg2576-Control的细菌种群分布差异为0.024 (Q值＜0.05)；物种多样性也表现出类似的结果(图S3-S5)。摄入KRG恢复了肠道微生物群的多样性，特别是在摄入KRG的恢复过程中，乳杆菌(Lactobacillus)数量增加。 LDA(Linear discriminant analysis)评分证实，当KRG给药量为30 mg/kg/day时，乳杆菌(Lactobacillus)定殖增加，而双歧杆菌(Bifidobacterium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)和梭菌(Clostridia)定殖减少(图5B)。给药100 mg/kg/day的KRG后，瘤胃球菌(Ruminococcus)、Anaerostipes和梭菌属(Clostridium)定殖减少(Q值＜0.05)。Tg2576-ST 30 mg/kg/day和100 mg/kg/day组的乳杆菌水平与WT组相当。  

图5 通过粪便样本16S基因测序分析肠道微生物群。(A) WT、Tg2576-Control、Tg2576-ST 30 mg/kg/day和Tg2576-ST 100 mg/kg/day肠道微生物群的代表属水平。与Tg2576-Control相比，Tg-2576-ST 30 mg/kg/day和Tg2576-ST 100 mg/kg/day的乳杆菌水平显著升高。(B) Tg2576-Control、Tg2576-ST 30 mg/kg/day、Tg2576-ST 100 mg/kg/day的LDA评分(Q值＜0.05)。

6 不良反应

在两周的实验期间，没有发生KRG给药的死亡或其他不良反应。对照组和给药组体重增长曲线均在正常范围内(图S6)。

讨论

在本研究中，我们试图通过肠-脑轴概念来检验红参诱导的认知增强之间的可能性。我们以Tg2576型AD小鼠为实验对象，复制了KRG摄入对认知功能改善的作用。我们评估了血脑屏障完整性的生物标志物，原因是血脑屏障可能受到AD的影响，以及血脑屏障是血液向大脑传递分子的主要选择性屏障，而这些分子是由肠道微生物群产生的，KRG改变了这些分子。这些实验数据支持KRG通过调节血脑屏障完整性减少Aβ积累和小胶质细胞激活来改善认知行为和AD病理。结合这些结果，我们发现肠道中受AD影响的主要微生物是乳杆菌(Lactobacillus)，而KRG可使其恢复。

乳杆菌可能在AD病理中起关键作用尚未见报道。乳杆菌与KRG诱导的大脑改善之间的直接因果关系需要确定，即肠脑轴的潜在作用。由于肠道微生物群参与了肠道和大脑之间的双向交流，肠-脑轴已被发现是研究神经生物学疾病的一个新的致病或治疗靶点。肠道微生物影响神经发育，调节行为，并会导致神经障碍。AD患者的肠道微生物群种类不同，是导致疾病进展的主要危险因素之一。Aβ蛋白的积累被认为是AD的核心病理分子，因为它通过自聚集引起神经毒性。因此，之前的研究和我们的研究结果都支持肠道微生物群可以影响大脑的病理，尤其是乳杆菌。

血脑屏障通透性和小胶质细胞激活是AD常见的病理现象。因此，肠道微生物群的变化与血脑屏障通透性或小胶质细胞的激活之间的关系可能支持通过肠-脑轴对AD的调控。微生物可以产生类似人类CNS Aβ的Aβ样分子，导致蛋白质错误折叠和小胶质细胞的激活。因此，控制肠道微生物产生的Aβ样蛋白可能是另一种策略。我们的研究结果表明，通过血脑屏障完整性(如Aβ蛋白积累和小胶质细胞激活)，微生物群的变化与AD病理之间可能存在相互作用。从我们的实验来看，KRG降低了小胶质细胞的激活，改变了血脑屏障的通透性。Claudin-5、层粘连蛋白、Occludin和CD13检测血脑屏障通透性和血管完整性，它们在Tg2576-Control与WT组间的表达差异以及KRG对其完整性的改善支持了之前的研究结果。

KRG引起的微生物群变化可产生不同的代谢物，其可能与AD的病理有关。肠道微生物调节小胶质细胞的激活，从而通过Aβ积累引起神经元损伤。肠道微生物群的破坏可以通过肠-脑轴导致AD发生或促进AD发展。以肠道微生物群为靶点可能是一种很有前景的改善AD的方法。在这项研究中，我们证明了摄入KRG可以调节AD的病理以及肠道微生物群的变化，这些发现支持了肠道微生物群和AD之间通过肠-脑轴的联系。

16S基因测序分析证实AD降低了肠道微生物群的多样性，特别是降低了乳杆菌的水平。经KRG给药14天后，微生物物种的基因数量发生了变化，乳杆菌恢复到WT组的水平。乳杆菌可以通过向血液中分泌乙酰胆碱来影响大脑功能，乙酰胆碱对记忆和注意力起着重要的神经递质作用。乳杆菌产生的代谢产物与人类相似，其影响血脑屏障的通透性和小胶质细胞的激活等大脑功能。此外，在本研究中提出的大多数结果中，KRG的作用在高浓度下并没有增强。抗氧化是KRG调节AD的机制之一，由此可以推断，在适宜浓度以上，过量的KRG会作为氧化源或发生副作用，产生可能影响AD加重的活性基群。

综上所述，AD小鼠模型中，KRG给药引起肠道微生物群特别是乳杆菌的改变。KRG也恢复了血脑屏障的完整性，减少了小胶质细胞的激活。小胶质细胞激活的减少和血脑屏障通透性的改变与Aβ积累的减少、记忆与认知的改善有关。 

结论

在本实验中，我们复制了KRG对AD模型小鼠病理的改善作用，恢复了因AD而减少的肠道微生物群多样性，特别是乳杆菌水平，还监测了血脑屏障完整性、小胶质细胞激活、Aβ积累和认知行为。综上所述，结合之前报道的研究结果，KRG给药诱导了乳杆菌的恢复，这可能通过Tg2576 AD小鼠的肠-脑轴发挥潜在作用。

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