食用鼠李糖乳杆菌JB-1后血液中的细菌膜泡和噬菌体

导读  

       肠道微生物群在宿主的生理、发育和免疫中具有多种作用。尽管被上皮细胞限制在肠腔内，但微生物通过特征不明确的机制影响远端系统。最近的研究考虑了细胞外囊泡在种间通讯中的作用，但它们是否参与了系统微生物-宿主相互作用尚不清楚。在本研究中，我们证明了独特的纳米颗粒 可以在食用鼠李糖乳杆菌JB-1(Lacticaseibacillus rhamnosus JB-1)后2.5小时内从小鼠血液中分离出来。与盐水喂养小鼠的血液纳米颗粒相比，其复制了脂磷壁酸介导的原始细菌的免疫功能，包括激活TLR2和增加树突状细胞IL-10表达。与被喂食细菌一样，它们也减少了肠上皮细胞系中TNF诱导的IL-8。虽然这些分离的纳米颗粒富含宿主神经元蛋白，但也含有被喂食细菌来源的蛋白质和病毒(噬菌体)DNA。本研究的数据强烈表明，口服活细菌可迅速导致其膜泡和噬菌体的循环，并显示出有益细菌和益生菌可系统地影响其宿主的纳米颗粒通路。

实验设计

结果

1 来自JB-1喂养小鼠的血液纳米颗粒在体外复制一些与JB-1相关的活性

       我们假设，小鼠在摄入JB-1后所观察到的效应是由循环纳米颗粒介导的。为了验证这一点，我们用2×109 JB-1细菌或PBS灌胃BALB/c小鼠，2.5小时后(与JB-1诱导的脑区域激活一致)从每组6-12只动物中收集血浆，并超离心获得循环纳米颗粒(简便起见我们称之为EV)。然后我们在体外测试EV与JB-1治疗的效果。使用TLR2报告细胞系，我们发现，与PBS组相比，JB-1组小鼠的EV对TLR2的激活程度更高(t10=5.69, d=1.78, p<0.0001;图1a)。当与骨髓源性树突状细胞(BMDCs)共培养时，EV诱导IL-10表达升高(t6 =3.2, d=0.60, p=0.0094;图1b)。在TNF诱导的人肠上皮细胞系(T84) IL-8表达模型中，JB-1喂养小鼠的EV对IL-8的抑制程度大于PBS喂养小鼠(t3=5.11, d=0.96, p=0.007;图1c)。这些结果表明，在食用这种细菌后不久，小鼠的血浆中就存在类似于JB-1的免疫调节活性纳米颗粒。

图1 鼠李糖乳杆菌JB-1的体外繁殖活性。

(a) EV激活的TLR2通过使用报告细胞的比色法定量，数据以合成TLR2配体Pam3CSK4 (300 ng/mL)的活性百分比表示。

(b) EV与BMDCs共培养，随后流式细胞仪检测IL-10的表达。

(c) EV与T84细胞预培养2 h，暴露于0或2.5 ng/mL TNF 2 h，ELISA检测IL-8分泌量。误差条表示标准误。每个点代表一个EV制剂(每个制剂收集6-12只小鼠)。**p＜0.01, ***p＜0.001。

  2 神经元蛋白在JB-1喂养小鼠的血液纳米颗粒中相对丰富

       为了研究JB-1的摄入是否影响小鼠血浆EV蛋白组，我们使用UniProt小鼠数据库进行了蛋白质组分析。在JB-1和PBS喂养小鼠的EV样品中检测到了3421个蛋白。其中，19个在JB-1喂养小鼠的EV中显著增加，6个显著减少(图2a;表S1)。此外，我们发现19个蛋白在所有JB-1喂养小鼠的EV制剂中均能检测到，17个蛋白在PBS喂养小鼠的EV制剂中均能检测到(表S2)。我们使用Gene Ontology(GO)富集分析确定富集蛋白是否与任何特定过程相关。有趣的是，JB-1喂养小鼠的EV中上调的蛋白质在与神经元结构和功能相关的术语以及与一般细胞过程相关的术语中富集(图2b;表S3)。对JB-1喂养小鼠的EV中下调的蛋白进行分析，没有发现任何显著富集的术语。所有已鉴定的蛋白质或通路均不具有任何可鉴定的免疫活性，也不与与我们评估的功能相关的已知免疫通路相关。相反，它们可能反映了由JB-1摄入引起的外周和中枢神经元活动增加(已知由食用JB-1引起)时释放的EV。

图2 鼠李糖乳杆菌JB-1喂养小鼠的EV富含神经元蛋白。(a)火山图比较JB-1或PBS喂养小鼠的EV中检测到的单个蛋白的相对强度。(b)相对于PBS喂养小鼠，JB-1喂养小鼠的EV中富集的EV蛋白的GO富集分析，显示FDR<0.05的项。数据来自每组3个EV制剂。

  3 食用JB-1影响小鼠循环纳米颗粒的组成

       通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)(图3)，我们发现JB-1喂养小鼠的EV平均直径为134 nm(mode 105 nm)，而PBS喂养小鼠的EV平均直径为130 nm(mode 103 nm)，但这在统计学上没有显著差异(t11=1.73, d=0.34, p=0.11)。各组间EV平均浓度的差异也并不显著(t11=0.97, d=0.15, p=0.35)，JB-1喂养小鼠的EV平均浓度为2.6×1010 EV/mL，PBS喂养小鼠的EV平均浓度为2.3×1010 EV/mL。通过方差分析比较JB-1和PBS喂养小鼠的EV的标准化粒径分布，发现颗粒间相互作用显著(F=9.3，η2G=0.002, p=0.002)，而后续成对比较分析显示234 nm到254 nm (ds=0.51-0.61)之间存在显著差异(ps＜0.05)，如图3a所示。这些数据表明，喂食JB-1会影响循环EV的组成。

图3 从喂食鼠李糖乳杆菌JB-1的小鼠血浆中分离的EV具有独特的粒径分布，并含有JB-1来源的蛋白质、噬菌体DNA和脂磷壁酸。

(a)采用纳米颗粒跟踪分析(图)表征喂食了JB-1或PBS的小鼠EV的粒径分布，透射电子显微镜(插入图像)用于可视化EV的粒径分布。比例尺50 nm。条代表12个EV制剂的标准误差。箭头和星号表示显著差异区(p＜0.05)。

(b)用平板读取器评估CFSE标记的JB-1或PBS喂养小鼠的血浆EV中CFSE相关荧光。数据显示后减去PBS空白孔。(c-e) qPCR产物的DNA电泳结果显示:(c)在JB-1喂养小鼠的基因组DNA (gDNA)和EV中检测到Prophage 1 DNA，但在naïve小鼠盲肠内容物和PBS喂养小鼠的EV中未检测到Prophage 1 DNA，而(d)在JB-1喂养小鼠的基因组DNA中检测到Prophage 2和Prophage 3 DNA。全长凝胶如图S5所示。(f)在使用或不使用anti-LTA抗体进行预培养后，评估报告细胞系中EV的TLR2活性。数据以合成TLR2配体Pam3CSK4的活性百分比表示(300 ng/mL)。(g)分别与anti-LTA抗体预培养和与EV样品培养后，流式细胞术计数表达IL-10的BMDCs。误差条表示标准误差；*p＜0.05。

  4 血液纳米颗粒含有来自喂食细菌的蛋白质

       为了检测来自JB-1喂养小鼠的EV是否含有JB-1来源的蛋白质，我们用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记了JB-1，CFSE是一种荧光团，可共价且稳定地结合我们以前用于标记JB-1 MV的细胞内胺。我们证实CFSE对细菌生长没有影响(图S1)，然后用CFSE标记的JB-1灌胃小鼠，2.5 h后收集血浆EV。使用荧光板阅读器，我们在CFSE标记的JB-1喂养小鼠的EV制剂中发现了可检测到的荧光(图3b)。

  5 鼠李糖乳杆菌JB-1编码可诱导的原噬菌体

       CFSE标记蛋白的存在使我们想知道是否可以在JB-1喂养小鼠的EV中检测到细菌蛋白。因此，我们使用另一个特征明确的相关菌株L. rhamnosus GG(登录号:FM179322.1)的数据库重新分析了我们的蛋白质组学数据。两组共检测到95个蛋白，我们怀疑大多数蛋白与来自本地微生物群的线粒体蛋白或细菌蛋白同源，因为在所有PBS喂养小鼠的EV制剂中只有4个蛋白缺失。其中，在三种JB-1喂养小鼠的EV制剂中的至少两种中仅检测到两个：预测的磷酸葡萄糖胺变位酶(LGG_00981)和预测的噬菌体尾部相关成分(LGG_01524)。后者促使我们研究JB-1是否携带一种功能性细菌病毒(噬菌体)，该病毒在其基因组中处于休眠状态(原噬菌体)，这也可能是EV制剂的组成部分。

       利用三种原噬菌体预测工具，我们预测了L. rhamnosus GG基因组上三种完整的原噬菌体的存在(图S2)，它们可能具有诱导(唤醒)、裂解宿主细菌和释放噬菌体后代的能力。Prophages 1(~42 kb;表S4)和Prophages 2(~33kb;表S5)分别与细菌噬菌体iLp84(NC_028783)和乳杆菌噬菌体Lc-Nu(NC_007501)部分同源。相比之下，Prophage 3要小得多(~15 kb;表S6)，没有相似的噬菌体同源物。根据ViPTree分析，这3种噬菌体均与Siphoviridae科病毒聚类。

       为了验证这些预测，我们进行了经典的噬菌体诱导实验。我们将鼠李糖乳杆菌JB-1暴露于DNA损伤剂丝裂霉素C中，过滤掉细菌成分，用DNAse处理去除任何自由漂浮的DNA，并使用针对每个噬菌体区域的特异性引物检测受蛋白保护的噬菌体DNA的存在，这与功能性噬菌体颗粒一致。在浓缩滤液的提取液中均可检测到这三种预测噬菌体(图S3A)，而细菌16S则检测不到(图S3B)，证明它们是完整的噬菌体，可以独立于JB-1细菌以颗粒形式存在。

       为了确定这些噬菌体是否能在没有应激源的情况下与培养的JB-1 MV自然结合，我们采用相同的DNAse处理，然后采用PCR检测JB-1 MV制剂中的噬菌体DNA。尽管这三种噬菌体的DNA即使在DNAse处理后也能检测到，但只有Prophage 1在高水平上始终能检测到(图S4)。

6 JB-1喂养小鼠的血液纳米颗粒含有细菌噬菌体DNA

       在培养过程中，Prophage 1与JB-1 MV的强相关性表明，其DNA可以作为JB-1来源的纳米颗粒在JB-1喂养小鼠血液EV中存在的条形码。我们首先从naïve小鼠微生物群中分离出的DNA中检测到这三种噬菌体中的任何一种。我们在盲肠内容物中没有检测到Prophages 1、2和3的DNA(图3c-e)，Prophages 3的引物在大范围内扩增了微弱的产物，表明存在一些非特异性结合(图S5)。然后通过qPCR检测血液EV样本中是否可以检测到噬菌体DNA。我们在JB-1喂养小鼠的EV制剂中发现了Prophage 1 DNA(平均33个循环)，但在PBS喂养小鼠中没有发现(图3c)。我们没有检测到Prophages 2或Prophages 3 DNA(图3d-e)，这表明复制的Prophages 1 DNA的富集，而不仅仅是染色体DNA，在染色体DNA中，三种噬菌体具有相同的代表性。这可能反映了血液EV制剂中存在Prophage 1颗粒，尽管复制噬菌体可能是细胞中丰富的复制子，因此其DNA更有可能在MV中发现，包括细胞内容物。总之，这些数据表明，JB-1喂养小鼠血液的纳米颗粒分离物中存在来自JB-1的核酸。

  7 JB -1喂养小鼠血液中提取的纳米颗粒的活性是由脂磷壁酸介导的

      我们最近发现，JB-1 MV含有免疫调节LTA。为了确定JB-1喂养小鼠的EV中是否存在相同的活性，我们使用了抗体中和试验。anti-LTA抗体预培养显著降低了JB-1喂养小鼠而非PBS喂养小鼠的EV对报告细胞系TLR2的激活(t3=3.22, d=0.86, p=0.024;图3f)和BMDCs中IL-10表达(t3=3.00, d=1.81, p=0.029;图3g)的影响。总之，这些实验表明，细菌LTA存在于从JB-1喂养小鼠中分离的EV中，并在很大程度上介导其免疫活动。

  8 血浆中细菌来源颗粒的估计数量

      在JB-1喂养小鼠的EV中存在来自JB-1原接种物的细菌蛋白、DNA和LTA，这强烈表明这些分离物中存在完整的细菌MV。为了估计纳米颗粒的相对大小，我们比较了JB-1喂养的EV制剂与纯细菌培养的JB-1 MV的特征曲线。通过结合这三种独立的方法，我们估计在JB-1喂养小鼠血浆中存在108-109 MV/mL(图4a-c)。上述纳米颗粒追踪分析的平均值为2.6×1010 EV/mL，这表明从JB-1喂养小鼠血浆中收集的纳米颗粒中有0.4%-4%是细菌来源。

图4 鼠李糖乳杆菌JB-1喂养小鼠的血浆EV中细菌MV的测定。通过纳米颗粒跟踪分析列举了JB-1 MV，并利用这些生成(a)报告细胞系中MV激活TLR2的标准曲线，(b) CFSE标记MV后的CFSE荧光，(c)检测到Prophage 1 DNA的qPCR循环数(ct)。水平虚线显示JB-1喂养小鼠在相同检测中的EV平均值。水平线和响应趋势的交点是对平均EV制剂中MV数量的估计。

  9 JB-1 MV制剂口服后出现在血液中

       我们的数据表明，在肠道原位产生的JB-1 MV易位上皮并进入血液。我们想知道直接喂食JB-1 MV是否会出现类似的易位。因此，我们用CFSE标记JB-1 MV，灌胃BALB/c小鼠，按之前的方法收集EV。这些EV含有CFSE荧光，并激活TLR2，但激活程度低于喂食JB-1细菌后的水平(图S6A-B)。有趣的是，从JB-1 MV喂养小鼠的EV中分离到的DNA含有Prophage 1和Prophage 3 DNA(图S6C)，与JB-1在正常培养条件下释放的噬菌体一致(图S4)。

讨论

       细菌MV是细菌与宿主通讯的很有前景的媒介，但这是否仅限于肠腔还是与全身影响有关尚不清楚。在本研究中，我们发现小鼠在食用鼠李糖乳杆菌JB-1后2.5小时内，血液中循环的功能性EV含有与喂食细菌相关的活性。这些EV似乎至少部分是细菌MV，因为它们的活性受到anti-LTA抗体的抑制，且颗粒中含有荧光蛋白和JB-1来源的噬菌体。

       我们之前已经证明，JB-1可抑制TNF诱导的肠上皮细胞释放IL-8，激活TLR2，并在DCs中诱导免疫调节表型，所有这些都与来自JB-1喂养而非PBS喂养的小鼠血液中的EV相关。此外，我们最近证明了JB-1 MV含有LTA，可以激活TLR2，并诱导DCs在体外产生IL-10。此处EV相关的活性被anti-LTA抗体抑制，这支持了这些效应主要是由纳米颗粒相关的JB-1 LTA介导。此外，这些数据表明，益生菌表面的生物活性成分不仅存在于体内循环的纳米颗粒上，而且即使通过胃肠道也保持活性。这可能对此类细菌的治疗应用有重要意义，这可能是由结构可变的成分(如LTA)介导。

       我们在喂食JB-1 2.5小时后检测了血浆纳米颗粒，因为我们最近发现JB-1在这个时间段内产生了区域大脑激活。这一时间间隔也与Karlsson及其同事的发现一致，他们描述了肠上皮细胞在摄入大剂量卵清蛋白后2小时内产生血液纳米颗粒(称为耐受体)，这介导了MHC Ⅱ依赖性的抗原特异性耐受。我们估计，从JB-1喂养小鼠的血液中分离出的颗粒中有0.4%-4%是细菌来源，这可能是不完美的，但尽管如此，通过纳米颗粒跟踪分析，其仍在JB-1喂养和PBS喂养小鼠的EV浓度差异范围内。虽然我们确实在PBS喂养小鼠的血液中检测到一些低水平的活性，可能来自原有的肠道细菌，但我们的估计并没有忽略这个基线。由于JB-1 MV可以被小鼠肠道上皮细胞迅速内吞，我们的数据支持了一种机制，即含有LTA的MV被肠上皮细胞迅速内化、转胞吞并全身循环，从而影响肠道远端系统，类似于亲本JB-1细菌。

       为了支持这一观点，Rubio和同事最近报道枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MV可被人结肠上皮细胞系Caco-2快速转胞吞；而Tulkens和同事证明革兰氏阴性菌MV的脂多糖可在人血液中检测到，特别是在肠道屏障功能障碍的个体中。在小鼠中，食用用脂溶性荧光团标记的Bacteroides thetaiotaomicron OMV可在8小时内在各个器官中检测到荧光，尤其是在肝脏中。从功能的角度来看，Aoki-Yoshida和他的同事证明，从喂食乳杆菌(Lactobacilli)7天的小鼠血液中沉淀出的纳米颗粒在体外对吞噬细胞具有抗炎作用。虽然作者推断这些作用是由于循环中的免疫调节外泌体，但我们认为它们也可能是由我们在本文中提出的机制驱动的。

       我们没有发现证据表明宿主EV参与了本研究中所观察到的纳米颗粒效应。蛋白质组学分析没有显示任何功能相关的小鼠蛋白，尽管我们确实看到了神经元生理相关蛋白的富集。这可能反映了JB-1及其MV在中枢和外周神经系统功能上的公认活性，导致神经元EV释放进入循环增加(如从肠神经系统)。

       为了进一步鉴定活性血液颗粒的来源是细菌，我们用CFSE荧光标记鼠李糖乳杆菌JB-1，它在体内长时间稳定地与细胞内伯胺结合并发出荧光。因此，在喂食标记JB-1小鼠的EV中检测到的荧光反映了可能被原位包装到MV中的细胞溶质JB-1蛋白，这与我们在灌胃直接标记MV后的发现一致。此外，我们检测到的噬菌体DNA证实，在JB-1喂养小鼠的EV或其MV中含有JB-1原有的成分，该噬菌体DNA仅在JB-1中发现，而没有在原有的盲肠菌群中发现。虽然在这一阶段，我们不能确定这种噬菌体DNA以何种形式存在于血液中，但我们提出，肠道中的JB-1产生含有噬菌体DNA的MV，并转胞吞进入循环。事实上，以往的研究表明，噬菌体核酸甚至整个噬菌体都可以包含在细菌MV中。由于噬菌体编码的内溶酶被认为参与了一些革兰氏阳性细菌产生MV的过程，所以在噬菌体的活性复制过程中MV的产生应该会增加，这表明MV可能富含噬菌体DNA。

       尽管如此，也有可能检测到的噬菌体DNA代表了循环中的一组独立的颗粒。噬菌体可被肠上皮细胞内吞并长时间存活，它们也可以转胞吞肠上皮细胞。在健康人群的血液样本中可以发现活跃的肠道细菌噬菌体。此外，噬菌体可以直接调节哺乳动物系统。最近的研究表明，尽管噬菌体不能在哺乳动物细胞内复制，但仍然可以调节宿主的干扰素反应。重要的是，我们使用CFSE也可能在细菌中产生标记噬菌体蛋白，导致血液样本中出现标记噬菌体。虽然一些病毒衣壳已经被证明可以激活TLR2，但anti-LTA似乎不太可能抑制激活TLR2的噬菌体蛋白。我们不知道鉴定出的纳米噬菌体DNA是否代表活性噬菌体，但如果这种情况发生在其它有益菌株或益生菌上，那么它可能代表一种新的途径，使这些细菌可以产生系统性影响。

结论

       综上，我们已经证明口服有益细菌会导致循环纳米颗粒含有细菌组分，这些成分可能是细菌形成的膜泡。这些颗粒在多个系统中都有活性，并且与亲本细菌相关的复制活动支持了循环细菌MV可以介导其系统影响的可能性。本研究的数据进一步表明，肠道细菌噬菌体可能参与了它们的系统通讯，并为进一步研究MV和噬菌体在宿主-细菌通讯和益生菌功效中的作用打开了大门。