新型融合蛋白——蛋白转导结构域4‑超氧化物歧化酶1减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤的实验研究

陈靖宜 龚小芳 李清 刘菊英

十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院麻醉科 442000

国际麻醉学与复苏杂志,2021,42(11):1161-1165.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210311⁃00409

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本实验通过观察蛋白转导结构域（PTD4）‑超氧化物歧化酶（SOD）1对大鼠心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）模型肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）及丙二醛（MDA）的影响，探讨PTD4‑SOD1的心肌保护作用，为进一步研究适合心肌梗死患者冠状动脉再通及CPB下心脏直视手术时MI/RI的防治方案提供理论依据。

1 资料和方法      

1.1　实验动物及分组

40只SPF级雄性SD大鼠，体重（330 20） g，随机将大鼠分为4组（每组10只）：假手术组（S组），冠状动脉只穿线不结扎，30 min后由尾静脉给予0.9%氯化钠注射液1 ml；MI/RI组，缺血30 min，再灌注120 min，再灌注时由尾静脉给予0.9%氯化钠注射液1 ml；SOD1蛋白组（SOD1组），缺血30 min，再灌注120 min，于再灌注时由尾静脉给予SOD1蛋白500 μg，

1 ml；PTD4‑SOD1融合蛋白组（PTD4‑SOD1组），缺血30 min，再灌注120 min，于再灌注时尾静脉给予PTD4‑SOD1 500 μg，1 ml。

1.2　模型制备、标本采集及处理

1.2.1　MI/RI模型制备过程

健康雄性SPF级SD大鼠，使用10%水合氯醛腹腔注射（0.3 ml/100 g），麻醉后将大鼠仰卧位固定于手术台上，颈部及胸部常规备皮、消毒、铺巾，剪开颈部皮肤，暴露气管，使用规格为18 G的静脉留置针行气管插管术，接小动物呼吸机辅助呼吸（潮气量3 ml/100 g，频率60次/min，吸呼比3∶5），经右颈总动脉置管接压力换能器，使用BL‑420生物系统监测心电活动。于胸骨左侧约0.5 cm第3、4肋间隙处切皮，钝性分离肌肉，使用手术钳夹断左侧第3、第4肋骨，使用小型撑开器沿胸骨纵轴方向撑开胸骨，暴露心脏，适应性放置10 min，使用小镊子轻柔充分地撕开心包膜，适应性放置5 min，使用双移液器枪头套叠法代替打结法结扎左冠状动脉前降支（LAD）。观察心电图波形变化，若ST段抬高、T波高耸且左心室变为苍白色，为结扎成功。30 min后，松解LAD行再灌注，再灌注时心电图示ST段明显降低、T波下降且左心室由苍白色变为暗红色，为再灌注成功。

1.2.2　标本采集及处理

血标本：再灌注结束后，通过连有负压管的静脉采血针直接刺入左心室采血5 ml，经高温低速离心机离心8 min，使用移液器吸取上清液，存于1.5 ml离心管，置于−20 ℃冰箱，待标本收集完后，一并检测相关指标。使用比色法检测CK、LDH的含量，硫代巴比妥酸染色法检测MDA的含量。

心脏标本：待采血完毕后，使用眼科剪从主动脉根部快速剪断，使用0.9%氯化钠注射液经主动脉冲洗心腔，冲洗干净后使用免疫荧光检测PTD4‑SOD1在MI/RI模型中的穿模能力。

2 结 果      

2.1　一般情况观察

在室温25 ℃的环境中进行实验操作，所有大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后无麻醉意外发生，接呼吸机辅助呼吸，呼吸平稳，血压、心率稳定。采用手术钳夹断胸骨，能有效减少出血。使用小型撑开器撑开胸腔，手术视野清楚，便于操作。

2.2　免疫荧光结果

免疫荧光结果显示，S组、MI/RI组、SOD1组均没有代表融合蛋白的荧光出现，PTD4‑SOD1组出现荧光。见图1。

2.3　PTD4‑SOD1对MI/RI大鼠CK含量的影响

与S组比较，MI/RI组、SOD1组、PTD4‑SOD1组的CK含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；SOD1组CK含量与MI/RI组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与MI/RI组、SOD1组比较，PTD4‑SOD1组CK含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.4　PTD4‑SOD1对MI/RI大鼠LDH含量的影响

与S组比较，MI/RI组、SOD1组、PTD4‑SOD1组的LDH含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；SOD1组LDH含量与MI/RI组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与MI/RI组、SOD1组比较，PTD4‑SOD1组LDH含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.5　PTD4‑SOD1对MI/RI大鼠MDA含量的影响

与S组比较，MI/RI组、SOD1组、PTD4‑SOD1组的MDA含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；SOD1组MDA含量与MI/RI组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与MI/RI组、SOD1组比较，PTD4‑SOD1组MDA含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨 论      

本研究通过利用PTD技术将ROS清除剂SOD转导入细胞内部，通过对MI/RI大鼠血清CK、LDH、MDA含量的测定确定PTD4‑SOD1的心肌保护作用。

本研究结果显示：与S组比较，MI/RI组、SOD1组、PTD4‑SOD1组的CK含量明显升高；SOD1组CK含量与MI/RI组比较，差异无统计学意义；PTD4‑SOD1组CK含量与MI/RI组、SOD1组比较明显降低，差异均有统计学意义。表明结扎大鼠LAD后再通，造成MI/RI后大鼠血清CK含量明显升高。纯SOD1不能降低血清CK含量，但带有PTD4结构的SOD1能够明显降低血清CK含量，减少再灌注后CK的释放。

本研究结果显示：与S组比较，MI/RI组、SOD1组、PTD4‑SOD1组的LDH含量明显升高；SOD1组LDH含量与MI/RI组比较，差异无明显变化；PTD4‑SOD1组LDH含量与MI/RI组、SOD1组比较明显降低，差异均有统计学意义。表明结扎大鼠LAD后再通，造成MI/RI后大鼠血清LDH含量均明显升高。纯SOD1不能降低血清LDH含量，但带有PTD4结构的SOD1能够明显降低血清LDH含量，说明融合蛋白PTD4‑SOD1能够明显降低MI/RI大鼠血清LDH含量。

本研究结果显示：与S组比较，MI/RI组、SOD1组、PTD4‑SOD1组的MDA含量明显升高；SOD1组MDA含量与MI/RI组比较，差异无统计学意义；PTD4‑SOD1组MDA含量与MI/RI组、SOD1组比较明显降低，差异均有统计学意义。表明结扎大鼠LAD后再通，造成MI/RI后大鼠血清MDA含量均明显升高。纯SOD1不能降低血清MDA含量，但带有PTD4结构的SOD1能够明显降低血清MDA含量，说明PTD4‑SOD1能够明显降低MI/RI大鼠血清MDA含量。

本研究通过测定各组大鼠血清CK、LDH、MDA的含量变化，说明PTD4能够将外源性的SOD1转导入细胞内部，增强了心肌ROS清除系统的能力，减少缺血/再灌注时ROS的产生，抑制ROS引起的脂质过氧化反应，实现了对心肌细胞的保护作用。

国际麻醉学与复苏杂志 

主管：中华人民共和国

          国家卫生健康委员会

主办：中华医学会   徐州医科大学

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