科研| Cell子刊：一种细菌鞭毛蛋白表位的拮抗多效性（antagonistic pleiotropy）特征

编译：微科盟R. A，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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为了确定flg22的氨基酸序列对鞭毛蛋白功能的影响程度，我们构建了一个突变菌株库(Pa flg22)，表达了假单胞菌Pa中flg22结构域的几乎所有可能的单错义突变。为此，我们通过靶向所有Pa flg22密码子以替换为指定每个其他氨基酸的密码子来生成412个fliC等位基因克隆（图1A）。接下来，我们构建了一个Pa fliC突变体(Pa ΔfliC)，并将我们突变体纲要的每个单独克隆转化为这个非运动性菌株，以测试其运动性回补（图1A、1B和S1A）。为了消除假阴性，我们确证鞭毛蛋白在所有转化体中表达（图S1B）。只有18.7%的菌株显示出与野生型fliC转化体完全相同的运动性表型（图S1C）。虽然45%的转化子运动性显著降低，但34.8%的转化子没有运动性，类似于Pa ΔfliC（图S1C）。因此，我们深度突变谱中的绝大多数突变都会对Pa的运动性产生负面影响（图1C）。相比之下，只有少数突变增强了Pa运动性（图1D）。

基于“位点信息”（address-message）概念，表位的22个氨基酸可以分为两个功能域，而这一点可以由在 FLS2与Pa flg22复合物的晶体结构所支持（图 1E）。“位点”片段包含17个N-末端残基，并与FLS2相互作用。最后五个C末端残基定义了一个“信息”片段，该片段为共受体BRI1相关受体激酶1（BAK1）创建一个对接位点，因此它对于适当激活免疫反应很重要。我们使用flg22序列的保守性和结构以及“位点信息”的概念来解释每个氨基酸变化对运动性的影响（图1E-1G）。我们发现针对表位“信息”部分的突变对运动性几乎没有影响（图1G）。相反，“位点”（address）域中超过一半的残基（17个中的10个；>58%）对突变高度不耐受，因此对细菌运动性而言至关重要（图1E–1G）。当叠加在鞭毛蛋白flg22结构域上时，我们发现这些残基分布在两个小簇上，在结构上有助于螺旋-环-螺旋转变（图1F）。因此，这些簇的改变很可能受到构建功能性鞭毛所必需的结构所需的限制。这些非常保守的簇的氨基酸在来源于假单胞菌菌株的flg22表位（图11E；表S1；数据S1），只有 1.4% 的合成功能丧失突变出现在野生假单胞菌（表S2；数据S1）。

接下来，我们预测FLS2将集中在对运动性重要的保守残基上。为了验证这一点，我们研究了FLS2胞外区（FLS2ECD）和数千个突变的flg22肽之间的成对相互作用（图1A）。我们用了一个高密度肽阵列，该阵列包含针对全长Pa flg22以及在N-和C-末端部分或两者截断的表位变体的全替换（图S2A-S2E）。为了测试“位点信息”（address-message）段对与FLS2的相互作用的全部贡献，我们逐步敲除了flg22的两端（图S2D和S2E）。总的来说，我们对合成表位和FLS2ECD之间的3000多个成对相互作用进行了研究并分配了相互作用分数（图S2A）。接下来，我们关注全长表位突变肽，并使用依赖于四分位间距（IQR）的统计数据将它们的相互作用分数分配给不同的类别（图2A）。相互作用得分低于或高于野生型Pa flg22对照的IQR的肽被认为分别与FLS2ECD具有较弱或较强的相互作用（图2A）。相互作用得分高于或低于Pa flg22 IQR 1.5倍的肽被指定为显著不同（图2A）。用这种标准，我们发现23个肽突变体与FLS2ECD的相互作用显著增强。只有flg22D14H和flg22D14L的相互作用作用显著减少（图2A）。总的来说，74.5%的突变肽群保留了与FLS2ECD的相互作用。因此，很难通过单个氨基酸替换来破坏flg22-FLS2相互作用的稳定性。我们认为，在拟南芥中，这种相互作用的稳定性抵消了细菌通过单个氨基酸取代来逃逸免疫检测的企图。

图2. flg22的深度突变谱确定了控制与FLS2相互作用的氨基酸序列（A）全长突变谱得到的FLS2ECD和flg22肽之间相互作用分数的分布。根据四分位区间（IQR）分析，flg22肽与FLS2ECD的相互作用更强烈（紫色），类似（白色），或更弱（绿色）。相互作用得分>3.12或者得分<−2.86被定为与所有其他显著不同(B和C）flg22序列标识映射FLS2相互作用分数。降低或增强flg22-FLS2ECD相互作用强度的氨基酸突变分别以绿色或紫色突出标示。小写字母表示相互作用作用减少或改善。地址/信息段和氨基酸位点分别标示在顶部和底部(D和E）位点特异性评分矩阵热图，表示每个氨基酸变化对flg22-FLS2ECD相互作用的影响。产生flg22突变体的突变与FLS2相互作用分数低于（D）或高于（E）野生型Pa flg22的IQR分别用绿色或紫色表示。白色表示相互作用分数分布在Pa flg22 IQR中的变体(F）条形图，表示用相同氨基酸替换所有flg22位点所得到的相互作用分数之和如(G）,（F）所示，但对于每个氨基酸位点的所有替换。对于（F）和（G），显著降低或提高相互作用作用分数的替换分别用绿色或紫色标示。

然后，我们利用获得的数据集，绘制了所有程序化氨基酸替换对flg22-FLS2ECD相互作用的个体影响图谱（图2B-2G）。用带正电荷或负电荷的氨基酸替换“信息”片段的任何残基的突变，分别减少或增加了flg22-FLS2ECD相互作用（图2B-2G）。类似地，用Lys13交换带负电荷的氨基酸增强了与FLS2ECD的相互作用（图2E和2F）。因此，表位的地址和信息片段的局部静电电荷可以促进或破坏与FLS2的相互作用（图2G）。我们的分析显示，Asp14和Asp15（简称Asp14/15）与肽长度无关，它是与FLS2ECD相互作用的”位点”（address）片段的最关键残基（图S2F）。我们的发现与结构和功能研究的结果相一致。尽管其他残基具有高度保守性，但拟南芥FLS2受体还是极其精确地聚焦于表位的Asp14/15残基，这可能是因为该双链对在鞭毛蛋白flg22结构域中定义螺旋-环-螺旋转换的边界非常重要（图1F）。

接下来，我们预测：如果选择压力引起拮抗作用来微调细菌的运动和/或与FLS2的相互作用，我们应该能够检测到它们的分子足迹。为此，我们根据各自表位的相互作用得分，将我们收集的每个细菌突变株分配到我们之前定义的三个相互作用亚群中的一个（图2A）。然后我们分析了各组的运动性，发现相互作用亚组之间的密度分布没有显著差异（图3A）。然后，我们比较了每个残基对运动性和与FLS2相互作用的个体贡献（图S3A）。我们发现不变或高度保守的残基Leu3、Gly6和Ala16/17的突变保留在与FLS2相互作用的野生型水平，同时对运动性产生严重影响（图S3A）。第二组进化保守残基对运动性维持或FLS2相互作用均未显示出整体不利影响（图1C和S3A）。因此，进化保守性不是FLS2检测拟南芥鞭毛蛋白表位的唯一标准。

图3. 拮抗多效性限制了非免疫原性（non-immunogenic）flg22表位的进化（A）散点图，表示Pa转化子（x轴）和flg22-FLS2相互作用分数（y轴）之间的关系。每个转化子根据Pa flg22IQR被分配到一个相互作用的亚群，并相应地进行着色。边距表示相互作用子组颜色编码的密度分布。各亚组的密度分布无统计学差异（Kolmogorov-Smirnov检验，KS>0.6）(B)用Asp14/15替代赖氨酸会破坏Ps的泳动能力。顶部图片显示Ps ΔfliC菌株的运动表型，辅之以空载体(EV)或fliC变异体编码flg22D14K或编码flg22D14K或flg22D15K表位的fliC变体回补fliC菌株。比例尺：0.5cm。下图：指定Ps菌株泳动的量化。具有相同字母的基因型在>95%的置信度下是不可区分的（所有两两比较均采用单因素方差分析，其次是Tukey的HSD；P<0.05)。生物独立观察数（n）标示在图表顶部(C）GCI推导的FLS2/flg22相互作用动力学。所示为传感器图，数据为橙色（Pa flg22）或绿色（flg22D14K/flg22D15K），相应的配合用黑色覆盖。nd：未确定。

然而，我们发现Asp14/15的突变能够以比任何其他残基更高的频率破坏与FLS2的相互作用，并破坏细菌运动（图S3A-S3C）。为了证实这些结果的广泛意义，我们测试了针对Asp14/15的突变是否也会破坏寄主特异性植物病原菌丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae，Ps）的活力。我们把重点放在flg22D14K和D15K上，因为这些替换明显破坏了与FLS2ECD的相互作用。首先，我们设计了Ps-fliC基因，使其编码Pa-flg22表位，并随后验证得到的基因回补Ps ΔfliC运动性（图S3D）。然后，我们使用这种工程菌株独立地引入针对Asp14/15双链体的错义突变。半固体培养基上的运动试验以及液体条件下的活体实验表明，这两种突变株都没有运动（图3B；视频S1）。接下来，我们在光栅耦合干涉（grating-coupled interferometry，GCI）分析中验证了这些突变表位不再与FLS2ECD相互作用（图3C）。因此，Asp14/15双峰维持假单胞菌运动的适应性在FLS2存在时是不稳定的，这也定义了AP的典型特征。然后我们推断细菌一定进化出了减轻这两个残基介导的拮抗作用的方法。因此，我们的合成集合中的一些菌株具有一组针对Asp14或Asp15的重叠突变，允许部分恢复运动，同时仍然阻止与FLS2的最大相互作用（图S3C）。由于这些合成突变可以作为Asp15在与野生拟南芥相关的假单胞菌致病谱系中的自然变异发生（表S1和S2；数据S1），我们提出在进化过程中仔细平衡的权衡已经发生，以最大限度地规避FLS2检测，同时保持次优（suboptimal）鞭毛蛋白功能。

接下来，我们评估了通过深度序列/相互作用突变谱鉴定的突变表位的免疫原性功能。为此，除flg22D14K和flg22D15K外，我们选择了均匀覆盖FLS2相互作用得分分布两端的表位衍生物（图S4A级；数据S2和S3）。共有44种合成肽，包括10种属于显著增强相互作用（SEI）组的变体，随后进行了测试，并与野生型和fls2突变植物中Pa flg22的免疫原性反应进行了系统比较（图4A和S4B–S4F）。我们所有的分析也包括不活跃的Pa flg20肽作为额外的阴性对照。我们使用flg22诱导的活性氧（ROS）和幼苗生长抑制（SGI）测定来测量FLS2的激活，发现免疫信号在很大程度上取决于与FLS2的相互作用（图4A和S4B–S4F）。虽然少数突变体引发的反应稍强或稍弱，但大多数与Pa flg22相互作用的突变体都诱发了类似的免疫反应。只有flg22Q20C发现具有与其免疫原性活性相对应的相互作用评分，因此被视为异常值 (图S4G-S4K)。我们发现SEI组的抗原决定簇没有超过Pa flg22诱导的反应 (图4A、S4C、S4D和S4F)。事实上，其中4个突变体显示类似于flg20的反应 (图4A和S4B-S4F)。因此，我们使用GCI验证了这些变量与fls2的相互作用 (图S4L; 数据 S4)。

图4. 将FLS2相互作用从激活中解偶联作为产生非免疫原性（non-immunogenic）flg22表位策略（a）flg22诱导的幼苗生长抑制（SGI）。生物独立观察（n）标示在图表顶部。所测试的flg22肽标示在底部。通过增加与FLS2的相互作用分数，肽从左到右排列。使用线性混合模型（双侧t检验，然后使用Holm方法进行多重检验校正）评估统计显著性；∗P<0.05).（B）防御标记基因MYB51在表位处理下的根系表达模式。显示的是来自单个共焦截面的图像。表位标示在每个面板的顶部。flg22显示的比例尺为50 μm适用于所有图片(C）用底部所示的flg22肽衍生物处理后mVENUS信号强度的定量分析。生物独立观察数（n）标示在图表顶部。∗表示统计显著性（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验；P<0.05).

为了进一步证实这些结果，我们使用免疫标记基因表达的实时成像，并使用两组荧光转录报告系（图4B、4C、S4M和S4N）监测子叶和根的表皮细胞中的FLS2反应。与我们之前的结果一致的是，flg22D14K和flg22D15K在这些分析中没有活性（图4B和4C）。flg22I21D、flg22Q20D、flg22I21E和flg22G18F在这些分析中再次被证明是非免疫原性（non-immunogenic），而所有其他SEI肽在两种细胞类型中显示出与Pa flg22几乎相等的应答（图4B、4C、S4M和S4N）。与flg22K13D相比，flg22K13D在根和子叶中均诱导应答，flg22K13Y仅在子叶细胞中诱导应答（图S4M和S4N）。因此，拟南芥中FLS2对多态表位的反应是细胞类型依赖性的。总之，我们的结果表明，与FLS2的相互作用和激活是可以解耦的。这些发现与共同flg22表位中自然多态性介导的FLS2反应的解偶联一致。我们认为微生物可以利用这种功能性的解偶联来规避AP对Asp14/15残基的压力。

接下来，我们评估了非免疫原性（non-immunogenic）SEI肽组（以下简称niSEI）中的突变是否影响Pa或Ps的运动性，使用与上述相同的策略进行了研究。我们发现编码fliC突变体和flg22I21D或flg22G18F表位的菌株恢复了Pa的运动能力ΔfliC达到未突变fliC水平的一半，而携带flg22Q20D和flg22I21E的菌株未能做到这一点（图5A和S5A）。相反，这些基因突变体在拯救Ps的过程中起着相反的作用ΔfliC（图5B和S5B；视频S1）；携带flg22Q20D和flg22I21E表位的编码fliC突变体的菌株能够像携带Pa-flg22的菌株一样运动。值得注意的是，来自SEI亚组的所有免疫原性变体将运动性挽救至野生型对照组水平的至少一半（图S5C和S5D）。作为一种共受体，BAK1识别FLS2结合的flg22的Gly18和Leu19残基。由于这些残基位于Gln20和Ile21附近，我们研究了所有SEI变体的感知如何影响FLS2-BAK1在细胞和体外的相互作用。我们发现，所有的niSEI肽都未能触发最大杂合物的形成，而SEI肽则没有（图5C）。因此，位点18、20或21处的特定氨基酸替换通过调节FLS2-BAK1相互作用来解析AP。值得注意的是，位点20处的变化提供了Ps中AP的完全副通路（图5B）。因此，编码携带flg22Q20D表位的fliC突变体的Ps菌株能够在拟南芥中定殖，明显优于携带Pa-flg22的菌株，并造成更多的疾病症状（图5D-5F）。由于位点18、20或21的变化对Pa和Ps的运动没有同等的影响，我们提出AP的可调性取决于所考虑的细菌种类。

图5. flg22信息片段中拮抗多效性的可调性影响FLS2-BAK1相互作用并提供宿主定植优势；(A和B）Pa（A)和Ps（B）ΔfliC菌株的泳动定量，这些菌株用EV或编码fliC的Pa flg22突变体或niSEI flg22突变体转化。具有相同字母的基因型在>95%的置信度下无法区分（单向方差分析，然后是Tukey-HSD分析，用于所有成对比较；P< 0.05）。(C）使用酶联免疫吸附测定法在体外测量FLS2-BAK1异源复合物的形成。表示的是2 h内的相对吸光度（A650 nm)。对于（A-C），独立观察的数量（n）显示在每个图的顶部。(D）用EV或用 fliC变体编码或flg22Q20D转化的Ps ΔfliC菌株在顶部所示。将第0天和第3天的每片叶子面积的细菌数量（cfu/mL)取log10，并进行了标注。点代表来自两个独立实验的个体观察结果。n=样品数量，显示在底部（来自4个植物/样品的8个叶盘）。(E）使用上述细菌菌株和植物基因型量化叶病症状。对于（C-E）*表示统计显著性（单向方差分析，然后是Dunnett（C）或 Sidak（D和E）多重比较检验；P< 0.05）。(F)接种上述细菌菌株后5拍摄的叶子的代表性图片。植物基因型标注在了图的顶部。比例尺：1 cm。

接下来，我们在使用GCI的体外结合动力学，并确定所有niSEI肽诱导不稳定的FLS2-BAK1复合物（图6A和S6A；数据S4）。我们确认了这些结果通过使用共免疫沉淀分析（图6B）。FLS2/BAK1相互作用导致胞浆激酶BOTRYTIS诱导激酶1（BIK1）的磷酸化，用于下游信号传导。niSEI肽均未诱导BIK1磷酸化（图S6B）。意外的是，在体外flg22A22E触发BIK1磷酸化而不诱导FLS2-BAK1相互作用（图6B和S6B）。因此，flg22的离散多态性变化可以解除拟南芥FLS2的反应。我们的结果显示，这种解耦涉及监管机制，但尚未确定。与这一假设一致，一个共生的flg22表位子集断开了FLS2的信号输出。

图6. 作为抑制免疫途径的受体复合物形成的竞争性拮抗作用（a）flg22结合FLS2和BAK1的GCI衍生结合动力学。所示为传感器图，数据以橙色和紫色标示，相应的拟合以黑色覆盖。耦合（ka）和离解（kd）速率常数以及离解常数kd如图所示 (B）未处理或处理10天的拟南芥转基因幼苗（proFLS2:FLS2-GFP）中FLS2-BAK1共免疫沉淀（coIP/IP）的Western blot分析用不同的flg22肽(C）FLS2-BAK1杂合物形成测定体外酶联免疫吸附试验。表示的是:在Pa flg22（10 nM）单独或增加flg20、flg22Q20D或flg22I21D的浓度时，2 h的相对吸光度（abs 650nm）。∗表示统计显著性（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验；P<0.05)。(D）拟南芥转基因幼苗（proFLS2:FLS2-GFP）中FLS2-BAK1共免疫沉淀（co-IP/IP）的Western blot分析未处理，用Pa-flg22肽处理（10nM）单独或与顶部所示浓度的不同flg22肽共同处理。flg22肽的特性标示在左边。这个实验重复了两次，结果相似。

接下来，我们测试niSEI肽是否能否定Pa-flg22诱导的免疫标记基因细胞色素P450 71A12（CYP71A12）的激活。使用转录报告系统，我们确定，除flg22G18F外，所有niSEI肽均拮抗Pa flg22诱导的CYP71A12（图S6C）。相反，与FLS2相互作用较少的表位不能阻止Pa flg22诱导CYP71A12（图S6C）。然后我们测试了体外条件下，flg22Q20D和flg22I21D是否能拮抗Pa-flg22诱导的FLS2-BAK1杂合物的形成（图6C）。我们确定这两种肽在比Pa flg22高50倍的浓度下很容易抑制这种相互作用。相反，Pa flg20需要200倍的摩尔过量，才能达到相同的拮抗水平。最后，我们证明了体外实验中，是flg22Q20D和flg22I21D，而不是flg22D14K或flg22D15K，能拮抗flg22诱导的FLS2-BAK1相互作用（图6D）。因此，我们合成了拮抗flg22表位，抑制下游FLS2反应的激活，对运动性没有明显影响。

在下一步研究中，我们寻找通过我们的合成方法在假单胞菌的自然谱系中鉴定的替代物的发生。我们发现，在荧光假单胞菌和与植物相关的Ps病理突变体中，Asp15（而不是Asp14）以甘氨酸（flg22D15G）或Asn（flg22D15N）的形式出现。因为两种突变都降低了Pa的运动性（图S3C），我们假设Asp15残基的变异可能伴随着补偿假定的运动缺陷的伴随变化。为了验证这一点，我们使用互信息理论（MIT）分析了从假单胞菌基因组数据库中提取的fliC蛋白序列中多态性的共现（图7A；表S3）。我们发现flg22片段中位置15与17和18之间的协变分布在MIT分数的前 0.5%中（图7A）。我们检索了两个具有代表性的共变异表位，并对它们进行了实验验证。这些表位在”位点”（address）和“信息”片段中具有额外的多态性，命名为flg22GDG（Gly15/Asp18/Gly20）和flg22NSS（Asn15/Ser17/Ser22）。然后，我们开始了解这种多态性对免疫原性的功能影响（图7B）。作为对照，我们制备了嵌合肽（flg22chGDG和flg22chNSS），其中的信息片段融合到Pa flg22的地址，随后测试了它们体外诱导ROS爆发和FLS2-BAK1相互作用的能力（图7B和S7A）。虽然flg22NSS和flg22chNSS诱导正常的FLS2/BAK1相互作用和野生型ROS爆发，但flg22GDG和flg22chGDG不能这样做（图7B和S7A）。flg22NSS/flg22chNSS的结果表明，15位和17位之间的共变异可能不足以规避拟南芥中FLS2反应的诱导。

图7. 假单胞菌拮抗表位功能的自然发生。（A）来自假单胞菌基因组数据库的fliC蛋白质序列的互信息理论（MIT）热图。flg22段在右侧放大。顶部的彩色比例尺显示了位点之间的MIT熵得分值。底部flg22序列上的箭头表示Asp15随Ala17（flg22NSS）或Gly18（flg22GDG）共变异； (B和C）flg22诱导的氧化爆发表现为总光子数超过40以100%的浓度使用min.Pa flg22、flg22GDG、flg22NSS和相应的嵌合体flg22chGDG/flg22chNSS（B）以及在flg22chGDG变体（C）中再现不同的单和成对多态性组合的肽纳米。对于（B）∗表示统计显著性（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验；P<0.05)。(D）拟南芥转基因幼苗（proFLS2:FLS2-GFP）中FLS2–BAK1 coIP/IP的Western blot分析未处理（mock）或处理10天用上面所示的flg22肽；(E）与（D）相同，但幼苗单独用10nm Pa flg22处理或与10nm Pa flg22和2μM的flg22GDG/flg22chGDG共同处理； (F）用EV或编码Pa flg22、flg22GDG、flg22NSS或相应嵌合体flg22chGDG/flg22chNSS的fliC变体转化的ΔfliC菌株来定量其泳动性（swimming motility）；(C和F）具有相同字母的肽和基因型在>95%的置信度下是不可区分的（所有两两比较的单因素方差分析和Tukey的HSD；P<0.05)。生物独立观察的数量（n）标示在每个图表的顶部(G）描述AP在fliC功能中的作用的模型。AP通过平衡维持fliC功能的负压和规避FLS2检测的正压来维持flg22的等位基因多样性。AP的分离导致（1）表位激动剂功能降低和运动能力显著降低（绿色细菌），或（2）表位拮抗剂功能和运动能力中度降低（紫色细菌）。AP的自然分解是通过类似的机制发生的（蓝色细菌）。

为了解释flg22chGDG非免疫原性（non-immunogenic）的原因，我们合成了Pa flg22肽，其中分别引入替代物（flg22D15G、flg22G18D和flg22Q20G）或成对组合（flg22D15G/G18D、flg22D15G/Q20G和flg22G18D/Q20G）并测试了ROS反应（图7C）。flg22D15G介导的ROS爆发与Pa-flg22无明显区别。这些结果得到了在我们的肽阵列上观察到的这种变体的FLS2相互作用的轻微减少的结果的支持（图2D）。值得注意的是，flg22G18D和flg22Q20G诱导的ROS爆发反应低于Pa flg22，当突变同时发生（flg22G18D/Q20G）或与flg22D15G联合发生时，这些反应进一步降低（图7C）。因此，我们认为这些残基之间的正上位性相互作用会大大降低表位的免疫原性。接下来，我们推断在位点18处引入负电荷可以挽救flg22D15G的FLS2相互作用的轻微减少。第二，我们预计，这种负电荷的引入以及位点20处的变化将导致niSEI表位flg22G18F和flg22Q20D的分子表型（图5C、6C和6D），从而使flg22GDG能够拮抗Pa-flg22诱导的FLS2-BAK1相互作用。与预期一样，flg22GDG及其相应的嵌合体未能触发FLS2-BAK1杂合物的形成，并在体内和体外均有拮抗Pa-flg22的活性（图7D、7E、S7A和S7B）。我们认为，正上位性不仅通过正压介导拟南芥FLS2的规避检测，而且通过抑制FLS2-BAK1杂合物与拮抗表位的活性来抑制植物免疫系统的功能。

为了确定阳性上位性（positive epistasis）对鞭毛蛋白功能的影响，我们评估了flg22GDG多态性对Pa和Ps运动性的影响（图7F、S7C和S7D）。而具有flg22GDG表位的fliC突变体不能拯救Pa和PsΔfliC，嵌合体恢复了12.5%的Ps运动性，但在Pa中没有（图7F和S7D）。这些结果强调了运动的可调性依赖于物种的概念（图5A和5B）。当单独引入时，每一个突变都恢复了18.5%的PaΔfliC运动性（图S7C）。因此，残基15、18和20可以负相互作用以控制Pa的运动。用flg22NSS衍生物进行的对照互补分析产生了几乎相似的结果（图7F和S7D），并进一步表明假单胞菌的运动性对flg22中的残基共变异非常敏感。第20位（flg22Q20G）的自然多态性，如niSEI肽flg22Q20D（图5B），提供了AP最均衡的分辨率（图7C和S7B）。总之，我们的结果表明，正上位性相互作用介导逃规避疫系统检测导致鞭毛蛋白功能的负面影响。我们认为flg22GDG样多态性最终可能在拟南芥上持续存在，因为通过拮抗剂活性降低免疫系统检测的益处大于对运动功能的负面影响。

支持上述结果的是：我们发现flg22GDG等位基因出现在假单胞菌操作分类单元（Ps OTUs）的基因组中与野生拟南芥稳定结合（>1500个基因组）。因为flg22GDG等位基因在这些基因组中出现的频率很低（<0.1%；表S4；数据S1），我们认为该等位基因对拟南芥的定殖是不适应性的。相反，我们发现>85%的这些基因组编码两个不同的flg22表位，使人想起拮抗剂niSEI肽，在位点20和21处出现变化（表S4）。除了这些替换之外，用MIT算法分析的不到一半的OTUs基因组显示flg22的位点15和18之间存在共变异（图S7E和S7F；表S5）。因此，我们使用共变异作为标准来分类这些肽；在Asn15和Val18之间共变异的flg22肽，伴随着位点20和21处的替换，被命名为Var I（flg22V.I）（图S7E）；另一个仅在位点20和21处有取代的肽被命名为Var II（flg22V.II）（图S7E）。在活性氧爆发试验中，两个表位均证明无免疫原性（图S7G）。这与先前的结果一致，表明VarI不诱导SGI。重要的是，Pa flg22序列中Asn15的改变并不影响ROS爆发反应（图S7G）。因此，位点15处的替换不一定影响FLS2响应。相反，我们提出Var II免疫原性功能的丧失是由位点20和21处的变化介导的。根据获得的niSEI和flg22GDG表位的数据，我们假设Var I和Var II都可以作为FLS2拮抗剂。我们预测，体外条件下VarI和VarII减少了Pa-flg22诱导的FLS2-BAK1相互作用，尽管强度不同（图S7H）。与Var II相比，Var I更强烈地抑制Pa-flg22诱导的FLS2-BAK1复合物形成（图S7H）。我们的结果得到了Var I和Var II对CYP71A12的Pa flg22诱导的拮抗作用的支持。我们认为VarⅠ中第15位和第18位的共变异与第20位和第21位的变化正相关，从而增强拮抗剂的功能。因为Pa flg22中Asn15或Val18的单次替换可使Pa的运动性降低约70%（图S7I），可能是VarI和 VarII的多态性可能导致运动性降低。。或者，这种运动性降低是最小适应性的和/或由表位片段外的共同进化位点补偿的（图S7F）。我们假设通过拮抗剂活性降低FLS2功能比维持Ps OTUs的运动性更重要，从而促成了该谱系在拟南芥上的优势地位。

接下来，我们寻找基因组学证据来支持具有FLS2-BAK1拮抗剂活性的表位的设计可以为拟南芥定植提供广泛的优势。为此，我们分析了超过1000份天然拟南芥种质基因组中FLS2和BAK1的多态性。我们的分析显示，FLS2ECD中可以发生超过100个非同义变化（表S6）。其中，41个替换涉及位于富含亮氨酸重复序列（LRR）中的氨基酸，这些氨基酸直接参与与flg22（LRR2-16）的相互作用。拟南芥可能利用这种变异来提高FLS2对不同类型表位的选择性。与此一致的是，FLS2在陆地上表现出明显的表位选择性。与FLS2ECD相反，BAK1ECD中的多态性几乎不存在，只有一个非同义变化发生在细胞外膜旁结构域（表S6）。BAK1与30多种受体激酶进行物理相互作用，以调节其他免疫和发育途径。因为BAK1ECD中的单一氨基酸变化可以破坏重要信号通路的功能，我们将多态性的缺乏归因于这种“中心”功能。基于此，我们假设来自 Ps OTU的显性分离株已经进化，通过利用拟南芥中BAK1的受限“枢纽”功能，使 FLS2多态性变得无关紧要。这与我们的研究结果一致，85%以上的拟南芥分离物编码的表位能对抗FLS2-BAK1杂合物上Pa-flg22活性。具有拮抗功能的flg22表位的获得不仅限于假单胞菌，还可以发生在拟南芥微生物群中发现的α-和β-变形菌中。

有助于解释自然细菌群落如何维持核心微生物功能，同时规避免疫的进化机制的研究和报道很少，这主要是因为直接的分子证据很难通过实验获得。在这里，我们证明了AP改善了表位和免疫传感器之间的关系，反过来，我们也证明了细菌运动性和宿主识别之间的平衡在进化过程中是分子平衡的。

我们的结果表明flg22的>300的单一突变对Pa运动性有巨大影响。总的来说，我们的数据表明，flg2具有比预期更大的编码功能，该功能可大规模影响假单胞菌的运动，由此针对不太保守的残基的氨基酸变化也导致了严重的运动性缺陷。相反，一些保守氨基酸的突变对运动性没有明显影响。因此，表位中残基的进化不太可能由仅因在维持细菌运动性的选择性机制驱动。我们对flg22-FLS2相互作用的系统分析使我们能够确定，在拟南芥中，FLS2没有进化到监测运动所需的所有表位位置的水平。我们推测天然拟南芥种质已经在其鞭毛蛋白传感器中进化出这种能力，以微调和优先考虑它们对不同细菌的防御反应。与此一致的是，天然flg22表位诱导多种免疫反应。

大于1000个表位的定向进化扩展了我们对FLS2/flg22相互作用的理解。尽管我们的数据大多与已有的晶体学数据一致，但我们发现，除了针对Asp14/15、Gln20和Ile21的突变外，所有其他突变都针对具有与物理相互作用的侧链的残基FLS2ECD，在晶体结构中对相互作用没有重大影响。最值得注意的是，这种强大的相互作用仅通过在表位的C端部分引入具有相反静电荷的残基来调节。值得注意的是，这些静电效应在聚体衍生物15表位上被放大，这些衍生物被开花植物中的FLS2直向同源物普遍认为具有免疫原性。总的来说，我们建议在拟南芥中FLS2与突变鞭毛蛋白表位的强大相互作用建立了拮抗多效应，并有助于维持细菌种群中鞭毛蛋白表位的变异。

对拮抗多效性问题的一个显而易见的监管策略是简单地清除fliC。然而，在各种植物相关细菌中fliC的基因消除显著降低了它们的毒力。细菌利用其他机制来进行拮抗多效性的分解。几种假单胞菌的一种策略是通过分泌胞外蛋白酶来降解多余的鞭毛蛋白单体。另一种策略依赖于鞭毛蛋白糖基化。在一些植物特异性细菌中，独特的聚糖结构的加入阻止了表位释放，从而导致非免疫原性（non-immunogenic）鞭毛蛋白。正选择压力驱动flg22序列中多态性水平。然而，只有少数致病物种似乎利用这一策略，因为运动能力的降低对宿主的适应并非是最理想的。相比之下，共生群落的多态性水平相对较高。这可能表明这些群落较少依赖鞭毛介导的运动和/或在其基因组中保持多个fliC拷贝来解析拮抗多效性。或者，免疫抑制策略，例如由Ⅲ型分泌系统及其效应蛋白介导的免疫抑制策略，可用于减轻fliC或任何其他MAMP编码基因的压力。然而，在这种策略中，拮抗多效性的分解只能转移到其他过程，因为细菌效应子也被植物类Nod受体所识别。

我们已经确定鞭毛蛋白表位的突变轨迹，该表位通过产生拮抗剂来驱动植物免疫系统逃逸和中毒（图7G）。我们发现，在野生拟南芥相关的自然存在的细菌中，这些轨迹的特征是相互重叠的。虽然我们不能精确确定这些突变信号是如何出现的，但我们认为它们是通过一系列连续的突变事件而发生。首先，我们设想，自然选择引导规避免疫系统的检测，并因此通过建立拮抗多效性来阻止进化。第二系列的选择事件只能简略地解决拮抗多效性，但导致通过拮抗功能减少免疫检测的表位。这种新获得的功能之所以持续存在，是因为它为细菌定植提供了比仅仅恢复运动能力更大的好处（图7G）。此外，一种可能的情况包括以下一些事件(1)自然选择有利于在靶向信息片段中其他残基（例如，位点20）的15位点进行特定替换，因此，导致细菌保留适应性水平的运动性，同时携带免疫原性次优降低的表位，(2)拟南芥中BAK1的强负选择引导了15和18位之间频繁的平行共变，并且这些残基和20位残基之间的有益上位相互作用允许表位免疫原性完全降低，(3)这些替换也是有益的，因为它们会产生弱受体拮抗剂，因此可以防止BAK1功能对其他MAMP反应的过度发生。因此，通过避免其他竞争物种对宿主的“过度定殖”，从而实现和谐的微生物组组装群，(4)尽管对运动性有很大影响，但这种替代物的组合阳性选择允许携带此类表位的细菌在拟南芥上持续存在。由于第20位的多态性可以提供Ps中拮抗多效性的平衡分辨率，首先发生在第20位（或“信息”片段的其他关键残基中）的替换，随后是第15和18位的共变也会发生。为支持第二种情况，20位点是Ps OTUs菌株编码的flg22表位中多态性最强的。

总之，我们的研究提供了更好地了解其他MAMP受体对在植物在低等和高等后生动物中分子进化的一个理论基础。例如，我们的研究可以作为一个模板来剖析由延伸因子Tu（EF-Tu）介导的细菌蛋白质合成是如何在芸薹科特异性EF-Tu受体（EFR）的识别下进化的。了解拮抗多效性如何影响EF-Tu表位的序列变异以规避免疫检测，同时在翻译期最大限度地发挥核糖体功能具有重要意义。总体而言，这里探讨的概念有可能重构我们对非自身进化（non-self-evolution）的理解。