科研 | 北京大学（IF：7.963）：沉积物减轻抗生素对反硝化作用的抑制作用（国人佳作）

编译：微科盟清韵，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

抗生素和沉积物都会影响水生系统的反硝化作用。然而，目前对抗生素如何在沉积物存在的情况下影响反硝化作用知之甚少。本文研究了抗生素（磺胺甲噁唑、四环素和氧氟沙星）在沉淀物不存在和沉淀物存在的情况下对反硝化作用的影响。通过量化细菌的反硝化功能基因（DNGs）和16S-Seq以及抗生素抗性基因（ARGs）来揭示相关的影响机制。结果表明，抗生素的存在通过降低narG、nirK、nosZ、总DNGs和反硝化细菌的丰度来抑制NO3--N的还原。然而，这种抑制作用被沉积物的存在所缓解，沉积物的存在促进了细菌的生长，降低了抗生素作为细菌和抗生素载体的选择压力，从而增加了反硝化细菌和所有DNGs的丰度。偏最小二乘路径模型表明，抗生素对细菌、ARGs和DNGs有负效应，沉积物对ARGs有负效应，却对细菌和DNGs有正效应。网络分析进一步揭示了Bacillus、Acinetobacter和Enterobacter与ARGs和DNGs有密切关系。这些研究结果有助于理解抗生素污染的天然水域中的反硝化作用。

图文摘要    

论文ID

原名：Sediments alleviate the inhibition effects of antibiotics on denitrification: Functional gene, microbial community, and antibiotic resistance gene analysis

译名：沉积物减轻抗生素对反硝化作用的抑制作用：功能基因、微生物群落和抗生素抗性基因分析

期刊：Science of the Total Environment

IF：7.963

发表时间：2021.9.7

通讯作者：孙卫玲

通讯作者单位：北京大学

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2021.150092

实验材料与方法

前言

河流中硝酸盐（NO3--N）污染成为世界范围内日益严重的公共卫生问题。反硝化是天然水体去除氮的关键。随着抗生素在人类和动物中的广泛应用，在水环境中经常检测到ng/L到μg/L水平的抗生素。除了促进抗生素抗性基因（ARGs）的传播外，水环境中残留的抗生素还会干扰氮的微生物转化。以前的研究表明，抗生素可以抑制反硝化细菌的生长，改变反硝化细菌的群落结构和功能基因丰度（如narG、napA、nirK、nirS、norB和nosZ），增加NO2--N的积累。硫霉素和磺胺甲噁唑（SMX）可以促进NO2--N和N2O的积累，同时减缓了反硝化速率。SMX浓度的增加显著促进了N2O的释放。

悬浮泥沙普遍存在于天然河流中，在氮循环中发挥着重要作用，特别是在反硝化过程中。悬浮沉积物不仅可以释放有机或无机底物，还可以提供缺氧的环境，促进微生物的生长。因此，沉积物的存在显著加快了水系统中的反硝化速率，并增加了细菌的丰度。此外，沉积物可以吸附有机污染物，改变有机污染物对反硝化的影响。有研究发现环境相关浓度的万古霉素、氟甲喹和SMX会被天然沉积物吸附，对硝酸盐还原没有影响。暴露于土霉素（1μg/L）后，沉积物中硝酸还原酶基因的丰度增加。百菌清很容易被沉积物表面吸附，从而通过抑制微生物活性导致NO3−-N的积累。然而，尽管关于沉积物或抗生素对反硝化作用的影响的研究很多，但沉积物如何影响抗生素对反硝化和反硝化细菌群落的影响仍不清楚。

本研究选择SMX、TC和氧氟沙星（OFL）3种抗生素作为目标有机污染物。在无沉积物和有沉积物的条件下，研究了抗生素对NO3--N反硝化的影响。通过绝对定量、16S-seq和qPCR对反硝化微生物群落结构和功能基因进行分析，揭示抗生素和沉积物对反硝化作用的影响机制。此外，基于ARGs的高通量分析，研究了在不同抗生素胁迫下，ARGs的变化及其与NO3--N反硝化的关系。本研究为抗生素对反硝化作用的影响提供了新的视角，并强化了沉积物对抗生素污染的天然水体中NO3--N去除的重要性。

结果与讨论

1 抗生素对有无沉积物反硝化作用的影响

如图1a-c所示，NO3--N还原过程可分为两个阶段：缓慢适应阶段（0-6h）和快速反应阶段（6-12h）。相应地，细菌的生物量在适应期内保持不变，然后在快速反应阶段迅速增长（图S1）。这类似于地下水中的反硝化过程。在适应阶段，暴露于抗生素的NO3--N在环境（10和100μg/L）和废水浓度（1和10mg/L）下的去除率分别为12.0~27.6%和0.24~4.8%。在快速去除阶段，除暴露在100μg/L氧氟沙星（OFL）外，大多数NO3--N（96.1-100%）在环境浓度（10和100μg/L）下被去除。在100μg/L的OFL暴露组中，由于较低的生物量，仅有42.8%的NO3--N被去除（图S1c）。在废水浓度为1mg/L和10mg/L时，抗生素明显抑制细菌生长和NO3--N还原。

高浓度的抗生素（1mg/L和10mg/L）对NO3--N还原有明显的抑制作用。此外，抗生素对NO3--N还原的抑制作用遵循OFL>TC（四环素）>SMX（磺胺甲噁唑）的顺序。在抗生素浓度为1mg/L时，12h内NO3--N的去除率依次为SMX（56.0%）>TC（31.0%）>OFL（9.13%），这一结果与前人的发现是一致的。抗生素的浓度和类型是影响反硝化细菌敏感性的主要因素，其敏感性顺序为恩诺沙星（ENR）>TC>SMX>ETM>克林霉素（CLI）（100ng/L~100mg/L）。以前的研究进一步表明，添加环境浓度（50~300μg/L）的OTC和环丙沙星（CIP）对反硝化作用没有明显影响，而对NO3--N的还原作用，在较高浓度（10~100mg/L）下的抑制作用依次为SMX>金霉素（CTC）>阿莫西林（AMX）>CIP。

图1. 无沉淀物条件下抗生素（10μg/L-10mg/L）对反硝化的影响。

根据0~10g/L不同浓度的沉积物下的NO3--N还原率和NO2--N的最大浓度（Text 4和图S2），选择10g/L的沉积物来研究抗生素在沉积物存在下对反硝化的影响。与没有沉积物存在的反硝化曲线相比，沉积物的存在显著减轻了SMX、TC和OFL的抑制作用（图2a-c）。在无沉淀物的情况下，SMX、TC和OFL浓度为1mg/L时，NO3--N的最终去除率分别为56.0%、31.0%和9.13%，而在有沉淀物存在的情况下，相应的去除率分别为99.5%、100%和100%。沉积物对各种抗生素抑制作用的减轻可能归因于：（1）水相中的微生物倾向于附着在沉积物表面，这导致细菌在沉积物中的定殖和营养物质的富集而快速生长。已经发现沉积物可以作为细菌的载体，并显著增加细菌的丰度。（2）沉积物对抗生素的吸附降低了其在水相中的浓度。这降低了细菌中有效抗生素的浓度，因为吸附在沉积物上的抗生素的可利用性低于溶解的抗生素。事实上，如图S3所示，沉积物对抗生素有不同程度的吸附，这减轻了抗生素的毒性并缩短了缓慢适应阶段。

此外，与之前的研究结果一致，本研究观察到了NO2--N的积累，并且峰值的对应于NO3--N的快速去除（图1d-f）。与没有抗生素时相比，有抗生素时NO2--N的浓度仅略有增加。在无沉淀物的情况下，100μg/L的SMX和TC增加了NO2--N的积累，分别是对照样品的1.09倍和1.69倍。与NO3--N还原相比，NO2--N还原对抗生素更为敏感。100μg/L的TC没有显著影响NO3--N的还原，但显著增加了NO2--N的积累（图1e）。抗生素对NO2--N还原酶的影响比对NO3--N还原酶的影响更强。在沉积物存在的情况下，10和100μg/L的SMX、TC和OFL加快了NO2--N的还原，NO2--N的积累量分别比对照减少了32.14%、16.67%和5.4%（图2d-f）。此外，在1mg/L的抗生素浓度下观察到NO2--N的积累但迅速减少。这表明从水相中去除了氮。

图2. 在沉积物（10g/L）存在的情况下，抗生素（10μg/L~10mg/L）对反硝化的影响（误差棒表示标准差）。

2 反硝化功能基因的响应

负责反硝化作用的反硝化功能基因（DNGs）的丰度如图3和表S6所示。研究表明，DNGs的丰度与反硝化速率相关，DNGs的相对丰度可以表征反硝化过程。膜结合硝酸还原酶基因（narG）存在于Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria中，而周质硝酸还原酶基因（napA）只存在于Proteobacteria中。W组和S组中的narG的相对丰度均高于napA，表明膜结合硝酸还原酶可能在NO3--N还原中起重要作用（图3a和b）。与对照样品（W-CK）相比，W组narG的相对丰度下降，而napA的相对丰度无显著差异。这可能表明narG更容易受到抗生素（100μg/L）的影响。含铜亚硝酸还原酶基因（nirK）和含细胞色素cd1的亚硝酸还原酶基因（nirS）参与了NO2--N还原为NO的过程，且nirK的相对丰度高于nirS（图3c和d）。此外，W组nirK的相对丰度低于对照（W-CK），但nirS没有显著差异，表明nirK也容易被抗生素（100μg/L）抑制。不同于以往的研究，硝酸还原酶基因（narG和napA）的相对丰度显著高于亚硝酸还原酶基因（nirK和nirS），这解释了NO2--N的积累。

抗生素的添加显著降低了W组中的narG、nirK、nosZ和总DNGs的丰度（图3和图S4），进一步强调抗生素对反硝化具有抑制作用，特别是对NO3--N、NO2--N和N2O还原。有研究结果表明，当土霉素浓度大于0.25mg/L时，DNGs的丰度显著降低。有研究还发现，暴露于SMZ、CTC或AMX后，narG基因的表达丰度显著降低。还有研究表明土壤中残留的抗生素降低了DNGs的丰度。本研究的结果表明，沉积物的添加显著增加了所有DNGs的相对丰度，尤其是napA和nirS的相对丰度。这解释了沉积物促进了NO3--N和NO2--N的还原（图2）。研究还观察到沉积物的存在增加了DNGs的丰度。这可以解释沉淀物的存在减轻了抗生素的抑制作用的事实。

图3. 不同处理组（W，无沉积物的水溶液；S，添加沉积物；抗生素浓度100μg/L；沉积物浓度10g/L）的反硝化功能基因丰度（误差棒表示标准差，不同字母表示不同样本间差异显著，单因素方差分析：p<0.05）。

3 细菌群落的变异

通过绝对量化16S-seq（AQS）评估了抗生素和沉积物对微生物多样性的影响。经过质量过滤、剪接和嵌合体去除之后，总共使用了1,535,122个reads用于后续的分析。不同样品有60-78个OTUs，其中25个OTUs为所有样品所共有（图S5a）。Venn图显示，在无沉积物和有沉积物存在的情况下，样品分别有28个和34个OTUs（图S5b和c）。W组和S组在群落丰富度（观察到的物种，Chao1，ACE）和多样性（Shannon，Simpson）方面没有显著差异（表S7）。但是，通过Bray-Curtis距离对细菌群落的PCoA分析表明，W组与S组的细菌群落是有差异的（图S6）。

抗生素的添加使细菌丰度从1.8×105降低到1.4×105-1.7×105copies/ng DNA（图4a）。有研究发现抗生素也会降低优势反硝化细菌属的丰度。相反，沉积物的添加显著增加了反硝化细菌的丰度。沉积物中的微生境和基质有利于细菌粘附在沉积物表面，导致反硝化细菌数量增加。此外，在S组中，抗生素对细菌的生长没有明显的抑制作用。结果表明，沉积物通过促进细菌的生长，缓解了SMX、TC和OFL的抑制作用（图2a-c）。

属水平上，Acinetobacter在所有样品中占优势，占总丰度的64.7-82.0%，其次是Enterobacter（1.66-8.69%）、Bacillus（1.73-7.17%）、Klebsiella（1.95-4.54%）和Lysinibacillus（0.60-2.45%）（图4b和S7）。具有反硝化性能的Acinetobacter广泛存在于天然和工程系统中，已从饮用水、地下水、城市活性污泥、制药废水和水产养殖废水中分离出来。与整个微生物群落相似，添加抗生素降低了W组中Acinetobacter的丰度，表明Acinetobacter也受到抗生素的影响。沉积物的添加增加了Acinetobacter的丰度。以前的研究发现沉积物中Acinetobacte的丰度与碳水化合物代谢有关，而碳水化合物代谢是由底物富集驱动的。

PICRUSt2对群落功能的预测揭示了所有样本中共有30条2级代谢通路和144条3级代谢通路，分别属于6个KEGG代谢通路组（1级）（图4c和图S8）。KEGG代谢途径为主要代谢组，占总相对丰度的81.4-82.1%。这与废水和垃圾渗滤液中的结果一致。辅助因子和维生素代谢（14.4~15.0%）、氨基酸代谢（13.9~14.3%）和碳水化合物代谢（12.0~12.8%）是2级最主要的代谢途径。氨基酸代谢的变化与反硝化细菌的耐受性有关。D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（3级）在反硝化过程中起着重要的作用，为反硝化过程提供碳和质子（图S8）和保护细菌免受氧化应激或化学毒性。这可能有助于反硝化细菌对抗生素的适应或抗性。此外，叶酸生物合成也是一株新型好氧反硝化菌Acinetobacter sp. YT03的主要代谢途径。

 图4. 不同暴露组门（A）和属（B）水平的微生物群落组成；（C）PICRUSt2基于通用引物对获得的16S rRNA标记基因预测的微生物群落代谢途径。

4. ARGs和MGEs的变化

为了探讨反硝化细菌对各种抗生素的耐药性，基于HT-qPCR技术检测了181个ARGs亚型和10个移动遗传元件（MGEs）（图5a-e和图S9）。检测到的耐药基因主要为多药耐药、β-内酰胺酶、四环素、磺胺、MLSB和氯霉素基因。向日葵（sunflower）图显示，所有样本共有37个基因（占总ARGs的20.4%）。S组（57）比W组（48）共享更多的参数。PCoA图显示S组与W组在第一轴上分离，可解释56.2%的方差。结果表明，沉积物的加入可能改变了细菌群落，尤其是携带ARGs的细菌群落。基因多样性可以被用来衡量抗生素抗性性状，这些性状受到水平基因转移或选择压力的影响。添加抗生素增加了W组的ARGs多样性，而S组则相反，尽管添加抗生素增加了ARGs的丰富度（表S8）。据报道，抗生素的添加增加了鱼肠道、土壤和电化学反应器中的ARGs多样性，这可能与抗生素的选择压力有关。

ARGs的相对丰度可以揭示携带ARG的细菌的百分比。其中，添加抗生素显著降低了W组和S组的ARGs相对丰度（图5f）。有研究显示，反硝化过程中的电子转移降低了抗生素的选择压力，导致ARGs水平下降。此外，W组ARGs相对丰度的下降可能归因于细菌丰度的下降。另一方面，沉积物的存在也降低了ARGs的相对丰度。这可能归因于这样一个事实，即抗生素在沉积物上的吸附缓解了抗生素的选择压力，这促进了没有ARGs的细菌的生长。

图5. （a-c）向日葵和维恩图（花瓣中的数字表示ARGs的数量），（d和e）网络分析，以及（f和g）不同抗生素（100μg/L）样品在无沉淀物和存在沉淀物（10g/L）的情况下ARGs的相对丰度。

5. PLS-PM分析和网络分析

PLS-PM分析（图6a）表明，抗生素对细菌（−0.088）、MGEs（−0.579）、ARGs（−0.533）和DNG（−0.361）有负面影响，进一步支持了抗生素可以抑制细菌生长，降低DNGs丰度的观点。这解释了抗生素对反硝化的抑制作用。沉积物对细菌（0.784）和DNGs（0.705）有显著的积极影响，进一步证实了沉积物的添加促进了细菌的生长，增加了DNGs的丰度，从而加速了反硝化作用。而沉积物对MGEs（−0.518）和ARGs（−0.838）有负面影响，这可能是因为沉积物的加入通过吸附缓解了抗生素的选择压力，促进了不含ARGs的细菌的生长。沉积物（0.705）和细菌（0.105）对DNGs有直接的正效应，而MEGs（−0.276）、抗生素（−0.361）和ARGs（−0.078）对DNGs有直接的负效应。

Spearman相关分析显示MGEs与ARGs呈密切正相关（r=0.88，p<0.01；图S11），这与PLS-PM的结果一致，即MGEs对ARGs显示出积极的影响（图6a）。网络分析（图6b）表明，编码转座酶的tnpA-01、Tp614和tnpA-05是模块2和模块4的“枢纽”基因，相关基因数量最多。之前的研究表明，细菌与ARGs的持续和再生密切相关。图6b进一步证明了Bacillus、Acinetobacter和Enterobacter与模块1中的ARGs和DNGs密切相关，不同类型的DNGs与ARGs和网络中的细菌密切相关，特别是nosZ作为模块1的“枢纽”基因，这可能表明nosZ和ARGs存在于同一宿主中。

本研究强调，由于抗生素广泛存在于水环境中，其对反硝化作用的影响不容忽视。此外，本研究还揭示了沉积物在缓解抗生素对反硝化作用中的关键作用，也揭示了抗生素和沉积物对反硝化作用的影响机制。这些研究结果为评估天然水域中抗生素的潜在风险提供了新的见解。

图6. （a）PLS-PM描述了抗生素、沉淀物、细菌、MGEs、ARGs和DNGs之间的关系，（b）网络分析揭示了ARGs、MGEs（整合子和转座酶）、DNGs和细菌之间的关系（节点按模块类别着色）。节点的形状和大小分别表示参数的类型和连接参数的数量。连接表示与Spearman相关系数有很强的相关性（p≥0.7或p≤−0.7）。

结论

本研究研究了3种常用抗生素在无沉积物和有沉积物条件下对反硝化作用的影响，并通过对微生物群落结构、DNGs和ARGs丰度进行分析揭示了其作用机理。结果表明，抗生素在相对较高浓度下对NO3--N的还原有抑制作用，其抑制程度为OFL>TC>SMX，其原因是由于抗生素降低了细菌、narG、nirK、nosZ和总DNGs的丰度。相反，在沉积物的存在下，由于细菌和所有DNGs的丰度增加，抑制作用显著减轻。ARGs分析表明，抗生素的添加降低了ARGs的相对丰度，这可能是由于反硝化过程中的电子传递降低了抗生素的选择压力。此外，沉积物的存在还降低了ARGs的相对丰度，因为抗生素在沉积物上的吸附减轻了抗生素的选择压力，促进了不含ARGs的细菌的生长。PLS-PM分析进一步证实了上述结果，表明抗生素对细菌、MGEs、ARGs和DNGs有负面影响，而沉积物对细菌和DNGs有正面影响。网络分析进一步证明Bacillus、Acinetobacter和Enterobacter与ARGs和DNGs密切相关。