萎缩性舌炎患者与健康人口腔微生物多样性分析

编译：微科盟大头虾，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

萎缩性舌炎（Atrophic glossitis）是口腔黏膜疾病中的常见病。目前的研究发现，人类口腔中含有大量多样的微生物，其组成和多样性可因各种口腔疾病而改变。了解萎缩性舌炎患者口腔微生物的组成及多样性，有助于进一步探讨萎缩性舌炎的发病机制。唾液微生物群由特定于每个人的土著口腔微生物组成，具有长期的稳定性。我们基于萎缩型舌炎患者和健康人唾液中细菌16S rRNA基因的V3-V4区和真菌rRNA基因的内转录间隔区 (internal transcribed spacer，ITS) 进行llumina MiSeq高通量测序，来探索口腔微生物组的组成和多样性。我们的报道揭示了萎缩性舌炎患者的细菌和真菌的多样性低于健康个体。这些数据进一步表明，乳酸菌和酵母菌是萎缩性舌炎发生和发展的潜在指标。此外，我们还讨论了口腔微生物生态与萎缩性舌炎的关系。

 论文ID

 原名：Oral microbial diversity analysis among atrophic glossitis patients and healthy individuals

译名：萎缩性舌炎患者与健康人口腔微生物多样性分析

期刊：Journal of Oral Microbiology

IF：5.474

发表时间：2021年10月7日

通讯作者：石晶

通讯作者单位：山西省人民医院（山西医科大学附属人民医院）口腔内科

DOI号：10.1080/20002297.2021.1984063 

实验设计

结果

1 参与者人口统计资料

本研究共纳入100人，其中包含50名萎缩性舌炎患者和50名健康个体 (24名男性和76名女性)。萎缩性舌炎组平均年龄为65.1± 10.4岁 (年龄范围：45-85岁) ，对照组平均年龄为60.9±11.6岁 (年龄范围：41-89岁) 。萎缩性舌炎的参与者在年龄和性别分布上与对照组没有显著差异 (所有p值＞0.05)。受试者的人口学和临床特征显示在表1。吸烟、饮酒、口腔健康状况、冠心病 (Coronary Disease，CAD) 和味觉异常在萎缩性舌炎组和对照组均未发现差异 (所有的p值＞0.05)。且萎缩性舌炎组与对照组在糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）、高血压、萎缩程度、贫血、舌体湿润、舌痛等方面差异均有显著差异 (所有的p值＜0.05)。 表1 萎缩性舌炎患者与健康人的临床特点。

2 微生物群落结构

我们的结果显示，本研究口腔微生物区系中相对丰度为>1%的主要细菌和真菌在属水平上发生了变化 (图1a,b)。对于细菌来说，链球菌Streptococcus, 普雷沃氏菌Prevotella, 奈瑟菌Neisseria, 罗氏菌Rothia, 韦永氏球菌属Veillonella, 嗜血杆菌Haemophilus, 梭杆菌Fusobacterium和细毛菌Leptotrichia是柱状图中最常见的属。而真菌有Saccharomycetales_unidentified_1, Agaricomycetes_unidentified_1, Saccharomyces, Fungi_unidentified_1_1, Aspergillus, 念珠菌Candida和马拉色菌Malassezia等真菌属最为常见。  

图1 所有参与者口腔冲洗样品中优势菌在属水平上的总体分布和相对丰度(>1%)。(a) 细菌；(b) 真菌。 比较2组参与者可以看到细菌和真菌的相对丰度 (图2a,b)。细菌方面，萎缩舌炎组的Streptococcus, Rothia, Porphyromonas和Gemella相对丰度高于对照组；而与对照组相比，Prevotella, Neisseria, Veillonella, Fusobacterium和Leptotrichia在萎缩舌炎组的丰度相对较低。真菌中，Saccharomycetales_unidentified_1, Candida在萎缩性舌炎组较对照组相对丰度较高；且萎缩舌炎组的Agaricomycetes_unidentified_1, Saccharomyces, Aspergillus和Malassezia相对丰度低于对照组。 在属水平上，相对丰度＞1%的主要细菌和真菌属在图3中列出，带颜色的Z评分值代表了它们的相对丰度。 然后我们采用分层聚类的方法，将萎缩性舌炎组和对照组的鉴别种及标本沿二维 (轴) 方向排列。在萎缩性舌炎组和对照组之间，显著的模式出现时，在不同的集群内的分类单元的分布进行了比较。在图2 (a,b) 的可视化分析中，可以直观地看出组间优势属的一致性及其相对丰度的总体相似性，但无法比较组间相对丰度的显著差异。通过Wilcoxon秩和检验，我们进一步筛选出了组间差异显著的以下细菌，包括19个细菌属 (Alloprevotella, Oribacterium, Solobacterium, 真杆菌属Eubacterium, Sacchar ibacteria_genera_incertae_sedis, Lachnoanaerobaculum, 孪生球菌属Gemella, 放线菌Actinomyces, 乳酸菌Lactobacillus, Prevotella, Stomatobaculum, SR1_genera_incertae_sedis, Veillonella, Rothia, 密螺旋体Treponema, 消化链球菌属Peptostreptococcus, Catonella, 奇异菌Atopobium, 纤毛菌Leptotrichia) (图4a，p值＜0.05) 和1个真菌属 (Saccharomycetales_unidentified_1) (图4b，p值＜0.05)。 本研究揭示了萎缩程度与口腔微生物群落的关系，包括细菌和真菌 (图8a,b)，并将舌炎患者的萎缩程度分为轻度、中度、重度3组。在细菌方面，我们的分析显示，艾肯菌Eikenella与萎缩性舌炎患者的萎缩性程度有关，且相对丰度随萎缩性程度的增加而降低，各组间差异显著 (轻度VS中度；轻微VS严重) (图8a)。对于真菌，结果显示，Saccharomycetales_unidentified_1与萎缩程度无相关性，其相对丰度随萎缩程度的增加无变化 (图8b)。  

图2  在属水平上，2个类群相对丰富度的比较。对萎缩性舌炎组和对照组受试者唾液中主要微生物群丰富属的平均分类剖面。(a) 细菌；(b) 真菌。

图3 Heatmap图显示所有样本 (行) 中物种分离物的相对丰度(>1%) 在属水平上进行相应的聚类，归一化和Z值转换。从蓝色到红色的颜色梯度表明物种数量由小到大。(a) 细菌；(b) 真菌。

图4 在属水平上，样品组间物种差异显著，用箱线图表示物种在组内的分散程度和不同组间的相对丰度。(a) 细菌：箱线图显示19种显著不同的细菌种类。(b) 真菌：箱线图显示了1种显著不同的真菌种类。显著不同的组用星号*表示。1个星号 (*) 表示p＜0.05; 2个星号 (**) 表示p＜0.01; 3个星号 (***) 表示p＜0.001。

3 Alpha和beta多样性分析

为了概述本研究萎缩性舌炎组和对照组的生物alpha多样性指数 (图5)，我们测量了口腔微生物群的Shannon指数和Chao1指数。我们通过比较对组结果可以发现，在对组之间，其唾液样本的多样性方面有显著差异，即所有从萎缩性舌炎组收集的样本的多样性都比从对照组收集的样本的多样性要小，无论是细菌 (p值= 0.001899; Shannon指数) 或真菌 (p值= 0.010085；Shannon指数) 。然而，我们发现无论是细菌还是真菌在丰富度上，2组之间没有统计学显著差异 (p值＞0.05；Chao1指数)。 PCoA图显示Beta多样性在二维空间中表现为样本对之间的相似性和样本个体之间的关系。ADONIS分析发现，无论是细菌还是真菌，2组之间都有统计学意义上的差异 (p值= 1.00e-04) (图6)。LEfSe的枝状图代表了不同组的潜在生物标志物 (图7a,c)。在萎缩性舌炎组的属水平上，富集菌主要为g_Gemella、g_Lactobacillus和g_Allisonella。在科水平上，最丰富的真菌为f__Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis。而对照组在属水平上富集菌数最多的为g_Actinomyces、g_Mobiluncus、g_Alloprevotella、g_Prevotella、g_Eubacterium、g_Butyrivibrio、g_Lachnoanaerobaculum、g_Oribacterium、g_Stomatobaculum、g_Solobacterium、g_Megasphaera。在科水平上，f_Sporidiobolaceae和f_Pichiaceae的分布最为丰富。 线性判别分析 (Linear discriminant analysis，LDA) 通过LDA评分揭示了各组间显著的差异以及丰富的特征 (图7b,d)。在萎缩舌炎组检测到显著的细菌差异，g_Gemella和g_Lactobacillus在属水平上呈现较高的丰度 (LDA＞2, p＜0.05)；然而，在科水平上，f_Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis的丰度较高 (LDA＞2, p＜0.05)；在属水平上，g_Candida表现出较高的丰度 (LDA＞2, p＜0.05)。同样，在对照组中，以g_Streptococcus.s_uncultured_organism的较高丰度为例，体现了显著的细菌差异 (LDA＞2, p＜0.05)。在科水平上，f_Sporidiobolacea和f_Pichiaceae的丰度较高 (LDA＞2, p＜0.05)；并且在属水平上g_Ogataea丰度较高 (LDA＞2, p＜0.05)。  

图5 萎缩性舌炎组和对照组唾液Alpha多样性比较。Shannon指数显示萎缩性舌炎组唾液微生物多样性低于对照组。(a) 细菌: p = 0.001899 (c) 真菌: p = 0.010085。Chao1指数在2组间无显著差异。(b) 细菌: p > 0.05 (d) 真菌: p > 0.05。

  图6 萎缩性舌炎组和对照组唾液Beta多样性比较。 Bray Curtis距离的PCoA表示两组间和组内的相似性或差异性。 每个样本用1个点表示。 在1个散点图中，距离较远的点 (代表样本) 是不同的，可视化样本之间的Bray Curtis距离。 每个主坐标轴解释的方差的近似比例 (%) 在轴标签中报告。 (a) 细菌: Axis1解释所观察到的变异的12.92%，Axis2解释所观察到的变异的9.14%。 (c) 真菌: Axis1解释了34.58%的变异，Axis2解释了16.72%的变异。 ADONIS检验进一步显示两组间存在显著差异。 (b) 细菌: p = 1.00e-04； (d) 真菌: p = 1.00e-04。  

图7 由LEfSe定义的生物标志物分析。在分类上，萎缩性舌炎组与对照组在相对丰度上有显著差异。在萎缩性舌炎组 (红色) 和对照组 (绿色) 之间，显著不同的类群以不同的颜色节点表示。节点的直径与相对丰度成正比。从内到外圈的彩色节点代表从门到属层次的分类单元。LDA评分直方图显示各组间丰富特征有显著差异。(ab) 细菌；(cd) 真菌。

  图8 在属水平上萎缩程度与口腔微生物组间的相关性，用箱线图表示不同组间某些物种的萎缩程度及其相对丰度在组内的分散情况。 A1: 轻度组 (n = 16) ; A2: 中度组 (n = 21); A3: 重症组 (n = 13)。 显著不同的组用星号*表示。 (a) 细菌； (b) 真菌。

讨论

萎缩性舌炎是一种严重的口腔健康问题，与多种情况相关，而不是直接归因于黏膜的机械损伤，可发生在全身或局部条件下。近年来，随着人口老龄化，老年人患萎缩性舌炎的现象越来越多。在以往的研究中，白色念珠菌Candida albicans在萎缩性舌炎患者中有较高的定植率，并在萎缩性舌炎的发生和发展中至关重要。口腔是最复杂的微生物群落的栖息地之一，主要包括细菌、病毒、真菌、原生动物、古菌、噬菌体和CPR (一种细菌，被称为candidate phyla radiation)，但其仍未得到充分的研究，但最近的一些报道表明，口腔微生物多样性对于口腔健康至关重要。复杂口腔微生物群的相互作用和功能已成为人们关注的焦点。最近的研究分析了龋齿、牙周病、HIV和肠易激综合征的口腔微生物多样性，并探讨了它们与上述疾病的关系。因此，我们需要对口腔微生物进行全面的研究，了解病因与疾病的关系是很有必要的。然而，口腔微生物群的变化与萎缩性舌炎发病机制之间的关系尚不完全清楚，微生物的组成和多样性尚不完全清楚。本研究试图同时描述口腔萎缩性舌炎患者和宿主保健中的细菌和真菌，但这些细菌和真菌在其他研究中并没有被发现。本研究发现萎缩性舌炎组与对照组的糖尿病和高血压发生率有显著差异 (表1)。而前期研究显示糖尿病患者出现舌中部乳头萎缩病变，且与Candida有显著相关性。一般认为，I型糖尿病患者更容易受到真菌感染，尤其是Candida albicans。但研究发现Candida假菌丝的存在与糖化血红蛋白升高有关；高血糖可通过增加唾液葡萄糖水平来增加Candida的风险，这也许会促进Candida的过度生长。但也有研究发现，糖尿病患者与健康人之间Candida的定植无显著性差异，无论是I型糖尿病患者还是II型萎缩性舌炎患者，都不一定与Candida感染有关。

因此，糖尿病也可能引起萎缩性舌炎的发生或增强，但其导致Candida改变的观点仍有争议。此外，关于高血压与萎缩性舌炎的关系，目前尚少有研究。一项研究发现，一些有萎缩性病变的患者在服用低血压药物后，中部乳头状萎缩的患病率更高。因此，在我们的研究中，高血压可能是混淆变量。

本文是对萎缩性舌炎患者和健康人唾液微生物多样性进行研究的初步报告。在本研究中，我们观察到的细菌较多，而在属水平上真菌属较少（图1a,b）。我们可以看到这些物种聚集在一起，其中一些物种的特征模式评估了它们在组间的相对丰度变化 (图3)。造成这种现象的主要原因是：1）真菌的相对稀少 (基于cfu，微生物组＜0.1%)；2）真菌的遗传物质很难分离出来；以及3）许多真菌种用目前的方法是无法培养的。然而，细菌并不是引起口腔生态变化的唯一因素；真菌也很重要，这与近年来口腔微生物的显著比例保持一致。近年来，细菌-真菌的生态相互作用引起了研究人员极大的关注。例如，Jonathon L. Baker等人认为真菌在数量上存在不足，但真菌物种的细胞大小更大，这为真菌-细菌多物种生物膜创建了1个结构‘骨架（skeleton）’。此外，与周围的细菌相比，真菌可以一种不同的方式刺激宿主免疫系统，并产生不同的免疫结果，这可能导致系统炎症障碍。萎缩性舌炎病因多种多样，一般认为萎缩性舌炎的临床症状是慢性炎症的表现。因此，细菌-真菌复合生物膜的相互作用可能会潜在地影响萎缩性舌炎患者的口腔微生物生态。

萎缩性舌炎组几乎没有马拉色菌Malassezia，但在对照组发现了Malassezia (图2a,b)。而最近一项对15名成人牙周患者唾液样本的口腔真菌群落的研究发现，Malassezia的出现频率较低 (17%)。Hajishengallis等人认为特定的低丰度病原体可以被视为“关键病原体”，并通过将“健康的”微生物群改变为疾病状态来影响牙周病。我们需要更多的研究来理解这个问题--低丰度Malassezia能影响萎缩性舌炎的进展吗？然而，在我们之前的研究中，Malassezia在发热的老年人中作为一种高丰度的真菌存在，它是一种值得关注的重要真菌属。此外，Dupuy等人从唾液中观察到马拉色菌属的高流行率和丰度，并将其纳入口腔核心菌群；但Malassezia在口腔健康和疾病或口腔微生物群落动态中可能扮演的角色，但仍有待确定。

同时，研究人员提出，应基于年龄和这些伴随着不同疾病的差异，更好地研究微生物群落的多样性。不同的口腔疾病和患者的年龄阶段可能会导致相同特殊口腔微生物群的丰度和多样性的差异。这可能是Malassezia很少出现在萎缩性舌炎组的原因，但可能与其他口腔疾病相反。此外，结果表明在属水平上，对照组的真菌微生物组相对丰富 (图2b)，这与之前的一项研究的结果保持一致：从20名健康参与者中分离出来的Candida, Saccharomycetales和曲霉属真菌Aspergillus丰度最高。

长期以来，酸源性链球菌Streptococcus被认为是龋齿的病原体，在龋齿的进展中非常活跃。在我们的研究中，我们发现Streptococcus是最丰富的属，其丰度在萎缩性舌炎组高于对照组 (图2a)，但2组之间的相对丰度无显著性差异 (图4a)。LEfSe分析结果显示，g_Candida是萎缩性舌炎组的主要属 (图7d)。Jonathon L. Baker.等人认为，C. albicans和Streptococcus之间的种间相互作用的能力会加剧口腔念珠菌病的严重程度，这突出了界间相互作用在发病机制（这种日益被认可作为多重微生物疾病）中的重要性。它是否影响萎缩性舌炎的进展与定植C. albican? C. albican与Streptococcus的相互作用为探讨萎缩性舌炎的发病机制提供了新的思路。

在本研究中，g_prevotella是萎缩性舌炎中相对丰度较高的物种，且2组间有显著性差异 (图2a，图4a)。在许多研究中，Prevotella是口腔微生物群中1个常见的成员，其相对丰度有相当大的差异。在口腔中，它已被确定为一种潜在的病原体，与龋损和牙周炎有关。Prevotella的高水平可能与局部或全身炎症疾病有关，可能引起萎缩性舌炎的局部舌乳头炎。然而，在LEfSe分析中，我们可以发现，Prevotella不是萎缩性舌炎组的主要属，而是对照组中为主要属 (图7a,b)。Prevotella看起来似乎与萎缩性舌炎之间没有任何联系，这可能是因为本研究的非临床性质和样本量的变化。

本研究中，基于alpha多样性指数的结果显示，萎缩性舌炎患者的细菌和真菌多样性低于健康受试者 (图5a,c)。这可能意味着萎缩舌炎组的微生物群落组成与生理健康状况的一致性程度更高，这也意味着萎缩舌炎组的口腔生态可能导致细菌-真菌微生物群落多样性的下降。萎缩性舌炎组口腔黏膜的炎症状态可能会影响微生物的变化。萎缩性舌炎，一种炎症性疾病，可能影响细菌-真菌的组成和多样性。相反，在萎缩性舌炎中，口腔微生物群的减少可能会改变其多样性并引起炎症。Devine, D. A.等人认为炎症和抗炎反应都可能炎症和抗炎反应都可能在宿主组织中由口腔微生物群的成员诱导。上述结果表明，细菌-真菌多样性与萎缩性舌炎的关系更为复杂且相互关联。

对于细菌，我们发现g_ Lactobacillus是萎缩性舌炎组细菌属中相对丰度较低的物种 (图2a)，但在2组之间有显著差异 (图4a)，它是萎缩性舌炎组的主要属 (图7 a, b)。众所周知，乳酸菌Lactobacillus在龋齿中的存在水平显著升高，其产酸作用导致口腔环境形成低pH状态，在龋病进展中发挥重要作用。Lactobacillus也可能与萎缩性舌炎的发生有关。而真菌方面，Saccharomycetales_unidentified_1是萎蔫性舌炎属的高相对丰度种，2组间差异显著 (图2b、图4b)。结果表明，其相对丰度并没有随着萎缩性程度的增加而增加 (图8b)。由此可见，随着萎缩性程度的增加，Saccharomycetales_unidentified_1的过度生长并没有得到促进。但结果显示其仍是萎缩性舌炎组的主要属 (图7c,d)。因此，Saccharomycetales是萎缩性舌炎的重要真菌，可能影响萎缩性舌炎的进展。我们的结果显示，在萎缩性舌炎患者中，Eikenella与萎缩程度具有相关性 (图8a)。根据我们的研究，Eikenella的相对丰度很低。这将提醒我们注意，低丰度的物种是否会引起萎缩程度的变化。正如我们上面提到的，一些低丰度的物种可以影响疾病的进展。

综上所述，数据显示了所有受试者口腔菌群的群落结构和多样性。本研究揭示了Lactobacillus和Saccharomycetales是最有效的口腔微生物属，并与萎缩性舌炎相关。然而，我们没有足够的证据表明萎缩性舌炎的发生或发展与这些种有关。我们也不能将这些萎缩性舌炎的病理现象完全归因于特定口腔微生物群的改变。一方面，关于萎缩性舌炎的口腔微生物组的研究很少。另一方面，小样本量可能会限制我们检测萎缩性舌炎相关的口腔微生物的能力。然而，其他可能的原因也许会影响实验结果，包括不同地区和种族萎缩性舌炎的发病率不同，以及方法 (即DNA提取和测序技术) 的差异。此外，我们的研究使我们推测，宿主体内发生的变化可能会破坏与口腔微生物群的和谐平衡，口腔微生物群的变化也可能作为1个危险因素影响疾病的进展。如果我们扰乱了口腔微生物群的平衡，就会导致疾病。不平衡的口腔微生物群可能对一般健康有害。维持1个健康的口腔生态群落对健康至关重要，了解宿主如何与口腔微生物群相互作用有着深远的意义。共同优势口腔属的群体的整体健康与平衡之间的关系是1个需要进一步研究的课题。值得注意的是，口腔微生物组的关系应进行深入评估，在得出任何确定的结论之前，有必要进行更大规模的研究。

结论

本研究通过对萎缩性舌炎患者和健康人群口腔细菌和真菌的组成和多样性的分析，揭示了口腔细菌-真菌群落的复杂和相互关联的关系。本文还鉴定了与萎缩性舌炎相关的优势菌属和真菌属。此外，对于今后的研究，我们还需要更多的细菌-真菌种类来研究萎缩性舌炎，并考虑口腔微生物群与健康状况之间的关系。本研究有望为萎缩性舌炎的细菌-真菌特征研究提供线索，并引起人们对口腔微生物群与健康状况的相关性的更多关注。 

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