NEJM：基因治疗6年后，这个全身皮肤脱落的男孩有了正常社交

2021-12-26 22:04

2015年6月，一名7岁男孩住进了德国波鸿鲁尔大学儿童医院烧伤病房。他从出生时就出现全身水泡，四肢、后背和躯体侧面尤为严重【1】。

2015年6月，一名7岁男孩住进了德国波鸿鲁尔大学儿童医院烧伤病房。他从出生时就出现全身水泡，四肢、后背和躯体侧面尤为严重【1】。在入院前6周，这名男孩出现了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染，病情严重恶化，而入院后其全身60%的表皮完全脱落。 undefined

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图1. 交界型大疱性表皮松解症【2】

这名男孩患有一种严重的染色体隐性遗传病—— 交界型大疱性表皮松解症（JEB），也称致死性大疱性表皮松解症。其临床特点是反复出现水疱和感染，严重影响生活质量，甚至进展为皮肤癌。JEB预后差，现有疗法仅能减轻症状，超过40%的患者活不到青春期。

JEB可由编码层粘连蛋白laminin 332的LAMA3、LAMB3或LAMC2基因突变引起，这些突变导致半桥粒这种细胞间结构的改变或缺失，表皮干细胞逐渐耗竭，基底膜透明层内水泡的形成，最终破坏患者皮肤结构和机械性能。这名男孩正携带了LAMB3纯合突变（LAMB3编码laminin 332的β3链）。

2021年12月9日，《新英格兰医学杂志》（NEJM）发表德国团队通过转基因表皮移植治疗该患儿的6年随访结果【3】，其显示转基因移植表皮功能基本正常，未见肿瘤形成等不良事件，而未移植区域皮肤仍有皮损出现。更重要的是，他已经可以像同龄孩子那样开始社交了。

柳暗花明，转基因表皮移植使患儿转危为安

这名7岁患儿入院之后，医生们尝试了多种治疗手段，但都以失败告终，患儿奄奄一息。单纯把患儿的残留健康表皮细胞在体外培养后移植无法有效治疗JEB，因为这些表皮仍携带致病的基因突变，植入的表皮难以存活，无法实现皮肤正常功能。

在取得患儿父母的同意后，医生们决定大胆尝试转基因表皮移植治疗濒危患儿，他们的决定获得了波鸿地方医药监管机构和鲁尔大学伦理委员会的同情用药批准。此前曾有移植转基因表皮治疗两名JEB患者的先例，但所移植的表皮面积较小（仅0.06 m2），未显著改善患者生活质量。

治疗团队首先采集了患儿身体上没有大疱的皮肤，培养出原代角质形成细胞，然后利用逆转录病毒载体将正常的LAMB3基因整合到表皮角质细胞中，再用这些已被修复缺陷的角质细胞作为“种子”进行实验室体外培养，得到最终移植所用的足够数量的转基因表皮细胞。

2015年10月和11月，医疗人员先后两次对男孩进行了表皮移植治疗，移植表皮总面积近0.85 m2。在第一次手术时，患儿全身表皮脱落面积已达80%。移植10天后便观察到表皮存活，1个月后表皮便开始再生。最终患儿顺利出院。

转基因表皮移植后的4、8和21个月，医生对患儿皮肤随机活检10处。结果显示，表皮均保持正常形态，未见水疱、表皮糜烂或表皮和真皮分离的现象。层粘连蛋白laminin 332表达及半桥粒的形态和数量都在正常水平。

曲终奏雅，长期随访证实表皮功能基本正常

2021年初，研究团队再次对这名男孩进行了随访。这时，距离患儿接受转基因表皮移植已经近5年半。他恢复得很好，和同龄人一样参加各种社交活动。转基因表皮十分健康，即使摩擦也不易起水泡，没有皮肤挛缩等不良反应。

COVID-19疫情开始之前，该患儿的未移植皮肤区域每周使用药物治疗，以减少水泡形成，但由于疫情使治疗间断18个月，其未移植区域的皮肤上出现了大量水泡。

图2. 5年后的皮肤，黑色箭为未接受皮肤移植的区域【3】

男孩的各项皮肤指标，包括温度感知、触觉、肤色、湿度等，都正常吗？更关键的问题是，转基因有没有导致细胞不正常增生？德国团队做了一系列检查。

荧光原位杂交试验显示，再生表皮仅由转基因角质形成细胞组成。移植前，laminin 332-β3几乎检测不到，而转基因表皮含有大量laminin 332-β3，位于表皮-真皮交界处，与正常表皮相似。皮肤活检显示，转基因表皮分层规则，角化角质层正常，但表皮-真皮交界处平坦，无明确的网嵴，表皮层内可见一种被称为朗格汉斯细胞的免疫细胞以及皮脂腺和汗腺。转基因皮肤显示出轻微的皮肤纤维化，特点是弹性蛋白微纤维减少，以及轻度红斑和神经病变。表皮中出现正常数量的免疫细胞说明免疫功能的恢复，而皮脂腺和汗腺保证了皮肤的保湿功能。

图3. HE染色可见毛囊（HF）、汗腺（SB）与皮脂腺（SG）【3】

多项无创功能测试表明，男孩转基因表皮的平均失水量在移植后2年、3年和5年维持在正常范围内，而水泡区域的平均失水量则远高于正常范围。转基因表皮的水合作用在整个随访期间和5年后保持相对稳定，与健康对照人群相似。该患儿无需使用润肤膏或保湿剂。

研究团队还对转基因表皮的感觉功能进行了定量测试。他们发现，男孩的冷检测阈值和暖检测阈值在移植后2~5年内改善，并在5年后恢复正常。机械性疼痛阈值在整个随访期间都在正常范围内，但机械性刺激感知阈值始终低于正常值，尤其是右下肢。温度感知依赖于Aδ和C神经纤维，机械感知依赖于Aβ纤维。这些测试结果与患儿的轻度混合性神经障碍一致，且与Aβ纤维和Merkel细胞缺乏相关。

图4. 皮肤感觉功能检测结果【3】

研究人员还采用了窄谱带分光光度法测量四肢和红斑处的皮肤色素沉着情况。男孩的转基因表皮中黑色素水平与正常皮肤类似，血红蛋白水平在2和3年时高于正常对照组，5年时恢复正常值。水泡区域的皮肤则显示出重度红斑和极低的黑色素含量。

图5. 皮肤保湿功能、色素以及血红蛋白检测结果【3】

人们对于基因治疗的一个普遍担心是逆转录病毒载体整合入基因组后可能导致的基因毒性方面。但经过多方面评估，该患儿未出现细胞异常克隆或肿瘤形成。其他研究也显示，转基因表皮移植即使经过15年随访，也未见异常。

瑕不掩瑜，期待未来更精彩

这名如今已经13岁的JEB患儿的治疗经历提示，转基因表皮移植可有效治疗大面积JEB，而且可获得长期疗效。他接受转基因表皮移植后，未再出现水泡、糜烂等症状。

人类表皮细胞大约每1到2个月更新一次。研究人员推测这名男孩的转基因表皮在经历了30到60个更新周期后，仍然维持着相对正常的结构和功能。这提示移植表皮中一小部分被称为全克隆细胞（holoclone）的干细胞在表皮成活与再生中起到了关键作用，在移植的角化细胞大部分凋亡后，这些细胞可以继续分化增殖，产生祖细胞并最终分化成角质细胞。

这名男孩经过转基因表皮治疗的四肢皮肤色素沉着均匀，背部和侧面可见有色素区和脱色素区，这可能与不同植片中的黑素细胞数量不同有关。原来，医生进行背部和侧面的皮肤移植时利用了冷冻瓶制备植片，而黑素细胞对冷冻很敏感。黑素细胞分布不均，显然会影响外观。但是，表皮培养中黑素细胞的同质群体需要优化培养条件来进行表皮分化和分层，这些条件目前还不适合用于JEB的表皮培养。

患儿的右下肢精细触觉明显受损，可能与手术床准备时应用手术刀造成更深层的皮肤损伤有关，但也有可能是由于接受转基因细胞治疗前的感染反复发作使神经纤维受损所致。

那么，我们应该在婴儿期还是在已经出现慢性伤口的成人期治疗JEB，应该仅治疗有水泡的区域，还是针对最有可能发生水泡和感染的区域进行预防性治疗？

德国的治疗团队认为，早期表皮移植可能改善真皮功能，还可以防止疾病恶化。逐步进行表皮置换，即每次手术置换10%至20%的体表面积，在为移植提供良好伤口床的同时，可以将围手术期风险降至最低。

无论如何，这名男孩的成功治疗为采用细胞基因联合平台治疗其他类型大疱性表皮松解症或其他遗传皮肤病铺平了道路，而这一成功离不开过去几十年来使用角质成形细胞治疗严重烧伤的尝试。

参考文献：

1. Hirsch T, Rothoeft T, Teig N, et al. Regenerationof the entire human epider misusing transgenic stem cells. Nature 2017;551:327-32.

2. Rashidghamat E, Mellerio JE. Management of chronicwounds in patients with dystrophic epidermolysis bullosa: challenges andsolutions. Chronic Wound Care Management Research 2017;4:45-54.

3. Kueckelhaus M, Rothoeft T, Rosa RD, et al. Transgenicepidermal cultures for junctional epidermolysis bullosa — 5-year outcomes. N Engl J Med 2021;385:2264-70.