南京大学开发的下一代RNAi技术，及其在亨廷顿病等疾病中的应用

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

亨廷顿病（Huntington's disease）又称亨廷顿舞蹈症，是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，通常发生于中年，其特征为运动功能障碍（如不自主运动、舞蹈病和肌张力障碍）和认知功能下降。亨廷顿病是由突变的亨廷顿基因（mutant HTT，mHTT）发生CAG三核苷酸重复扩增引起的，虽然该发病机制已被阐释20多年，但仍然没有研发出治愈或减缓病程的治疗方法。由于亨廷顿病是单基因病，因此直接靶向致病基因mHTT的基因疗法被认为是最精准有效的方法。 寡核苷酸疗法可以通过使用小干扰RNA（siRNA）或反义寡核苷酸（ASO）来沉默致病基因的表达，靶向传统药物难以调控的靶点，被认为是很有前景的基因技术。 然而，寡核苷酸药物的研发仍面临着巨大挑战：

1）脑部递送问题：由于血脑屏障的存在，寡核苷酸药物通常难以递送至脑内，往往通过脑实质或鞘内注射的方式进入到大脑，这种给药方式有一定损伤。

2）深脑部生物分布效率差的问题：寡核苷酸药物向纹状体等深脑部递送缺乏高效的手段，因此也无法有效地降低整个纹状体区（HD主要病变区）mHTT蛋白的表达。

3）寡核苷酸药物的毒副作用：外源的寡核苷酸药物及其传输载体可能对机体产生毒性和免疫原性。 因此，需要开发一种方便、有效和安全的给药策略，从而改善寡核苷酸药物的深脑部分布不均和神经元摄取不足等问题。 2021年12月，南京大学生命科学学院陈熹教授和中山大学附属第一医院裴中教授团队合作，在 Brain 发表了题为：Therapeutic reversal of Huntington’s disease by in vivo self-assembled siRNAs 的封面论文。 该研究基于团队之前的创建的 siRNA体内自组装和递送技术 ，通过构建靶向亨廷顿病致病基因mHTT的体内自组装siRNA，实现了对亨廷顿病动物模型的有效治疗。  

2021年3月29日，南京大学生科院张辰宇教授、陈熹教授、闫超教授、李菁副教授作为共同通讯作者，在 Cell Research 发表了题为：In vivo self-assembled small RNAs as a new generation of RNAi therapeutics 的研究论文。 研究团队设计了可组合和可编程的遗传电路，该遗传电路能够重编程宿主肝脏，以指导siRNA的合成和自组装成分泌性外泌体，并通过循环外泌体促进siRNA的体内递送。这项最新技术具有重大理论意义和转化价值，提供了一种可行的策略来克服RNAi体内治疗应用的最重要障碍，让RNAi疗法治疗从癌症到代谢疾病成为可能。 详情：让RNAi疗法成为可能，张辰宇/陈熹团队开发下一代RNAi治疗技术

在这篇 Brain 论文中，研究团队利用合成生物学策略，通过向小鼠静脉注射可表达siRNA和外泌体膜表面靶向肽段的合成生物学基因环路（以质粒DNA的形式），将小鼠的肝脏重构成可以产生和分泌siRNA的器官，继而利用机体自身的外泌体体内传输途径，实现siRNA在体内稳定、高效、安全的传输。 如下图所示，当肝脏吞噬了静脉注射的用于表达mHTT siRNA和狂犬病毒糖蛋白肽段（RVG）的基因环路，肝脏细胞将被重塑，从而不断组装和分泌包裹了mHTT siRNA的外泌体，而且这种外泌体由于被RVG修饰从而具备了穿透血脑屏障和靶向神经元细胞的能力，因此，进入血液循环的外泌体将在RVG的引导下实现mHTT siRNA的脑内递送，从而降低mHTT蛋白的表达进而治疗毒蛋白引起的亨廷顿病症状。  

体内自组装siRNA的作用示意图 研究团队在三种亨廷顿病转基因小鼠模型证明了该技术方法的有效性。作者将表达合成生物学基因环路的质粒通过尾静脉注射到小鼠体内，通过检测小鼠的皮层、纹状体中mHTT siRNA及mHTT表达水平，发现肝脏持续地组装siRNA进入外泌体并分泌其进入血液循环，在RVG肽段的引导下，外泌体可以将siRNA输送到皮层和纹状体，从而有效地降低小鼠皮层和纹状体中mHTT基因的表达水平，减少皮层和纹状体中mHTT毒蛋白的聚集和改善小鼠运动协调能力。  

在亨廷顿小鼠模型中评估治疗效果。激光共聚焦免疫荧光显示皮层和纹状体中mHTT毒蛋白的病理聚集。NeuN标记的是神经元核，EM48标记的是聚集的polyQ蛋白，DAPI标记的是细胞核，分别显示为红色，绿色和蓝色。结果显示治疗组（下）相比对照组（上）毒蛋白的积聚明显减少。 该研究的科学意义体现在：

1）基于合成生物策略设计出一个自动生产、组装、分泌、传输外泌体siRNA的系统，仅通过尾静脉注射裸露DNA质粒的方式就可实现特定组织的基因沉默作用。此系统基于体内固有的小RNA分泌、循环机制，利用机体自身的外泌体作为载体，实现了siRNA的脑内递送，这种“天然”的方式十分安全，避免了传统递送技术对机体带来的免疫原性和毒性，为未来治疗亨廷顿病开辟了新的途径。 

2）本研究实现了siRNA向脑深部区域的递送，实现了深脑区的基因沉默，有望推动帕金森病、阿尔茨海默病等其他神经退行性疾病治疗技术的开发。 

3）本研究通过对宿主肝脏进行重编程，使其能够执行用户自定义行为，实现了在复杂、动态的哺乳动物体内精确控制siRNA分布和靶基因表达，这一创新战略突破了目前合成生物学在生物医学中的应用局限。 Brain 杂志同期发表专题评论并给予了高度评价：“此siRNA递送技术出现是非常振奋人心的，它为siRNA向特定组织的精确递送提供了一个新的方法”。另外该评论指出“Zhang等人在多种亨廷顿病小鼠模型中展现了外泌体siRNA的治疗效果。该研究利用宿主肝组织分泌的外泌体将siRNA递送到神经系统的方法是非常有趣的，可能应用于其他神经系统疾病的治疗。这项工作实现了siRNA的脑内递送和亨廷顿病的治疗，为未来神经退行性疾病的治疗开辟了新路径”。  

而在此之前，研究团队为了证明这种下一代RNAi技术的治疗价值，已经在多种疾病相关的关键靶基因上进行验证： 肺癌 中的EGFR/KRAS基因， 胶质母细胞瘤 中的EGFR/TNC基因，以及 肥胖症 中的PTP1B基因。 静脉注射CMV-siR-EGFR能够显著减少原位肺癌模型中的肿瘤形成，延长小鼠寿命。静脉注射CMV-siR-KRAS同样。 静脉注射CMV-RVG-siR-EGFR+TNC可将siRNA有效递送至小鼠大脑并抑制胶质母细胞瘤生长，并显著延长小鼠寿命。 静脉注射CMV-RVG-siR-PTP1B，能够恢复肥胖小鼠模型的瘦素和胰岛素敏感性，减少肥胖并增加能量消耗。 这些实验结果表明，该体内自组装siRNA策略能够有效沉默上述关键靶点，并对肺癌、胶质母细胞瘤、肥胖症等三种典型疾病产生显著治疗效果。 而这篇 Brain 论文则表明了，体内自组装siRNA策略实现了siRNA的脑内递送和亨廷顿病的治疗，为未来神经退行性疾病的治疗开辟了新路径。 

论文链接： https://doi.org/10.1093/brain/awab354 https://www.nature.com/articles/s41422-021-00491-z