科研 | Cell子刊（IF：21.023）：人类肠道细菌代谢驱动Th17激活和结肠炎

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

由于E. lenta与Th17活性异常相关的自身免疫性疾病有关，我们试图确定E. lenta是否会影响小鼠Th17细胞，这些小鼠的Th17细胞在其整个生命周期中都被复杂的肠道菌群所定殖。我们每隔一天给无特定病原体(SPF)小鼠灌胃一种E. lenta型菌株(DSM 2243)或BHI(脑心浸出液)，连续2周，并通过qPCR证实了E. lenta的存在(图S1A)。与BHI相比，回肠和结肠固有层IL-17a+ CD4+细胞(Th17)在差异倍数、细胞百分比和绝对数量方面均显著增加(图1A和1B; 数据S1和S2)。IL-17a平均荧光强度(MFI)显著增加以响应E. lenta(图1C)。我们在IL-17f+ CD4+群和IL-17f MFI中观察到类似的模式，但在CD4+ Rorγt+群中没有显著差异(图S1B-S1D和1D-1F)。结果表明，E. lenta对CD4+ Rorγt+水平无明显影响，但其靶蛋白IL-17a和IL-17f的表达明显升高。此外，我们的研究结果表明，在整体微生物群中，E. lenta影响Th17活性。

为了评估在没有背景肠道菌群的情况下，E. lenta 2243定殖是否足以增加Th17活性，我们用E. lenta 2243单殖GF(无菌)小鼠2周。与GF小鼠相比，E. lenta单殖小鼠回肠和结肠中IL-17a+ CD4+细胞的差异倍数、百分比和数量增加，IL-17a MFI升高，但在脾脏中并没有升高(图1G-1I, S1E和S1F;数据S1和S2)。在E. lenta定殖小鼠中，CD4+ Rorγt+水平和Rorγt MFI未发生改变(图1J-1L; S1G和S1H)。E. lenta单殖对肠道IFNγ+ CD4+ T细胞、IL17a+ TCRγδ+ T细胞，或lineage-Rorγt+ IL-17a+ 3型先天淋巴细胞(ILC3)没有显著影响(图S1I S1P;数据S1和S2)。因此，不管是否有其他肠道微生物存在，E. lenta都会影响Th17的功能。

为了广泛评估E. lenta单殖小鼠CD4+ T细胞中基因表达相较于GF的变化，我们对分离的回肠固有层CD4+细胞进行了RNA-seq分析。该分析表明，Th17基因和Rorγt靶点在E. lenta定殖过程中显著富集(图1M,1N和S1Q; 表S1; p<10-6, 超几何分布检验)。GF和E. lenta单殖小鼠回肠组织的RT-qPCR分析证实了Rorγt靶点IL-17f和CCR6显著增加(图S1R)。调节性T细胞(Treg)相关转录因子(Foxp3)、辅助性T细胞1(Th1)相关转录因子(IFNγ，Tbet)或其他炎症标志物无显著变化(图S1R)。这些结果表明，E. lenta定殖特异性诱导Rorγt靶点。

图1 在肠道菌群存在和不存在的情况下，E. lenta定殖促进肠道Th17活性。(A-F) C57BL/6J SPF小鼠每隔一天灌胃BHI培养基对照或E. lenta 2243，连续2周。(A)代表性回肠流式图，(B) IL-17a+ CD4+细胞在CD3+门的差异倍数。(C)回肠和结肠固有层(LP) IL-17a平均荧光强度(MFI) (n=15)。数据来自三个独立的实验。(D)代表性回肠流式图，(E) Rorγt + CD4+细胞在CD3+门的差异倍数，(F)回肠和结肠LP中Rorγt MFI (n=5)。差异倍数与BHI有关。单个实验的数据。(G-L)无菌(GF)小鼠用E. lenta 2243定殖2周或保留GF。(G)代表性回肠流式图，(H) IL-17a+ CD4+细胞在活CD3+门的差异倍数，(I)回肠和结肠LP中IL-17a MFI (n=8-10)。(J)代表性回肠流式图，(K)CD4+ Rorγt+细胞在活CD3+门的差异倍数，(L)回肠和结肠LP中Rorγt MFI (n=8-10)。数据来自一个有代表性的实验；相对于GF的差异倍数；每个点代表一只小鼠；用平均值±SEM表示(A-L)。*p＜0.05;**p＜0.01; Welch’s t检验。(M和N) RNA-seq分析GF或E. lenta单殖小鼠回肠LP中CD4+细胞(n=4)。(M)由转录-靶相互作用确定的Rorγt靶点火山图(score＞1.5)。红点在E. lenta单殖小鼠和GF小鼠间表达差异显著(p＜0.05;Wald检验)。(N)不同Rorγt靶点转录本的热图(p＜0.05;Wald检验)。相比于Th0，红色的转录因子在Th17中增加(增加倍数＞1.5(Th17/Th0))。参见图S1和S2及数据S1和S2。

为了测试E. lenta通过改变可溶性免疫调节分子来改变Th17细胞功能，我们用2×浓缩无细胞上清液(CFS)、培养基对照或热灭活E. lenta细胞的小分子(＜3kDa)部分灌胃SPF小鼠(图2A)。CFS导致肠道Th17细胞(图2B和2C)和IL-17a MFI显著增加(图2D)。CFS处理小鼠回肠CD4+ IL-17f+细胞和IL-17f MFI水平升高(图S3A-S3C)。热灭活E. lenta对CD4+ IL-17f+或IL-17f+细胞或IL-17a或IL-17f水平没有显著影响(图2B-2D和S3A-S3C)。结果表明，具有代谢活性的E. lenta通过影响免疫调节小分子来诱导IL-17a和IL-17f。

为了进一步探索可溶性免疫调节分子的存在，我们进行了体外试验。用来自E. lenta 2243或对照组CFS处理Th17倾斜的脾源性CD4+ T细胞(图2E)。与对照组相比，未处理、热处理或3kDa过滤的CFS显著增加了IL-17a(图2F, S3D和S3E;数据S3)。BHI培养基显著降低了IL-17a的产生，这为IL-17a表达抑制剂的存在提供了初步支持，该抑制剂在培养基中被E. lenta生长所抵消(图2F, S3D和S3E)。

我们的小鼠实验表明，E. lenta在Th17分化和增殖的下游发挥作用。为了在体外解决这一问题，我们在多个时间点将E. lenta 2243 CFS加入Th17体外实验中，无论是在同一时间还是在倾斜后4天(图2E)。CFS在两个时间点均显著升高IL-17a水平(图2G)，而增殖无显著差异(图2H)。这些结果表明，E. lenta CFS影响细胞分化后IL-17a的产生，但对细胞增殖没有显著影响。基于这些发现，我们预测E. lenta在适应性免疫反应之前可以快速增加Th17的激活，这与一个短期单殖实验一致，该实验显著增加了肠道Th17水平和IL-17a MFI(图S3G-S3K)。最后，使用Rorγ荧光素酶检测，我们发现BHI显著降低了Rorγ活性，类似于已知的Rorγ抑制剂熊果酸，而CFS没有产生影响(图2I, 2J和S3F)。这些数据表明，BHI培养基中存在的Rorγt抑制剂被E. lenta代谢成一种较弱的抑制剂。

我们的结果表明，Th17对E. lenta的响应不是由于特定的抗原，这与之前对肠道细菌和真菌的研究相反。为了检测抗原特异性，我们用BHI培养基(-对照)、E. lenta 2243或B. adolescentis BD1(+对照)处理SPF小鼠2周，然后分离回肠CD4+ T细胞，并用模拟(BHI)-、E. lenta-或B. adolescentis-loaded树突状细胞(DCs)激发(图2K)。与用BHI或青春双岐杆菌(B. adolescentis)处理小鼠的T细胞相比，从E. lenta处理小鼠中分离出来的T细胞的Th17水平显著升高，且不依赖DC裂解物和树突状细胞的存在(图2L和2M)。与之前的报道一致，B. adolescentis条件T细胞在受到B. adolescentis-loaded的DCs激发时仅IL-17a水平升高(图2N)。这些发现表明，E. lenta提高了IL-17a水平，而与抗原呈递无关，这可能解释了这种细菌在具有不同抗原刺激的多种自身免疫性疾病中的广泛关联。

图2 E. lenta通过解除Rorγt抑制以非依赖性抗原的方式诱导IL-17a。(A-D) (A) C57BL/6J SPF小鼠灌胃BHI(对照)、E. lenta 2243-无细胞上清液(CFS)或热灭活E. lenta2243(死)2周。BHI和CFS以3 kDa过滤，2×浓缩。(B)代表性流式图。(C) IL-17a+ CD4+细胞在活CD3+门的差异倍数。(D)回肠(相对于对照组) IL-17a MFI (n=4-5)。数据来自一个实验。(E-H) (E)E. lenta CFS Th17体外试验设计。(F)通过ELISA检测未处理、BHI、E. lenta CFS、热处理BHI或E. lenta CFS、3 kDa过滤BHI或E. lenta CFS的Th17倾斜细胞中IL-17a水平(相对于未处理)的差异倍数(n=4-8)。(G)通过ELISA检测IL-17a水平在倾斜前后添加处理时的差异倍数(n=14)。(H) MTT法定量CFS处理前后的增殖水平(相对于BHI)的差异倍数(n = 9)。数据来自两个独立实验。p值为Welch’s t检验。(I和J) (I) Rorγ荧光素酶检测：Rorγ荧光素酶报告细胞用BHI或E. lenta 2243 CFS处理，浓度为0.6253×(n=5)，熊果酸为667 nM，作为Rorγ抑制剂的阳性对照(n=2)，或未处理(n=2)。(J)通过冷发光—相对光单位(RLU)测量Rorγ活性。(K-N) (K)抗原特异性实验设计。(L)通过流式细胞术评估活CD3+门IL-17a+ CD4+的相对水平(相对于BHI T细胞对照的水平)。数据来自两个独立实验(n=10-12)。(M)从E. lenta定殖SPF小鼠中分离出的T细胞中CD4+ IL-17a+细胞在活CD3+群体中的差异倍数，这些T细胞与负载BHI、E. lenta、B. adolescentis裂解物的树突状细胞(DCs)共培养，无DCs或PI。水平是相对于BHI。(N)从SPF小鼠中分离出的T细胞中CD4+ IL-17a+细胞在活CD3+群体中的差异倍数，这些T细胞与负载BHI、E. lenta、B. adolescentis裂解物的DCs共培养，无DCs或PI。水平是相对于BHI对照。*p＜0.05;**p＜0.01;* **p＜0.001; ****p＜0.0001；除非另有说明，否则采用单因素方差分析Tukey或Holm Sidak检验。显示平均值±SEM。模型图在BioRender.com绘制。参见图S2和S3以及数据S3。

先前的研究发现，与健康对照组相比，在与Th17异常激活相关的疾病状态中，E. lenta的水平更高，如RA和MS。为了检测E. lenta是否也在IBD患者中富集，我们重新分析了两个共计105名IBD患者和100名健康受试者的宏基因组数据集。与对照组相比，IBD患者粪便样本中的E. lenta显著升高(图3A, 3B和S4A-S4C)。与独立IBD队列的对照组相比，IBD状态的E. lenta水平也升高(图S4D)。与之前的研究相比，这些发现表明E. lenta在一系列自身免疫性疾病中升高，揭示了E. lenta与自身免疫的广泛关联。

接下来，我们使用IBD小鼠模型来测试E. lenta定殖对疾病严重程度的影响。首先，在右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导结肠炎之前，用E. lenta定殖GF小鼠2周(图3C)。通过多种指标评估(疾病评分、结肠长度、通过组织学观察到的隐窝破坏以及结肠脂质运载蛋白水平)(图3D-3G和S4E)，发现E. lenta定殖小鼠患上比GF小鼠更严重的疾病。我们观察到在E. lenta作用下结肠和回肠Th17水平增加(图S4F和S4G)，其与结肠长度呈负相关(图S4H)。其次，我们给IL-10-/- SPF小鼠灌胃E. lenta或培养基对照(BHI)，每周3次，追踪体重和存活率(图3H)。结果发现，与对照组相比，E. lenta显著影响多种疾病指标，如体重降低、存活率降低和结肠脂质运载蛋白水平升高(图3I-3K)。

这些结果，以及我们之前发现的E. lenta定殖影响Rorγt靶点的表达，使我们假设E. lenta通过诱导Rorγt依赖性基因的表达导致结肠炎。为了验证这一假设，我们比较了野生型(WT)和Rorc-/- SPF小鼠，在DSS诱导前2周每隔一天灌胃E. lenta或BHI培养基对照(图3L)。通过疾病评分和结肠长度评估，E. lenta在WT小鼠中诱发更严重的疾病(图3M和3N)。相比之下，Rorc-/-小鼠的疾病严重程度在各组之间没有显著差异(图3O和3P)。灌胃E. lenta的WT小鼠回肠和结肠中Th17水平升高(图S4I和S4J)，但在Rorc-/-小鼠中两组的Th17水平均较低(图S4K和S4L)。WT小鼠结肠中Th17水平与结肠长度呈负相关(图S4M)。但我们不能排除Rorc-/-小鼠中缺失的其他细胞类型(例如ILC3细胞)或更广泛的胸腺缺陷的贡献，但这些结果与E. lenta以Rorc依赖性方式导致结肠炎恶化的假设一致。还需要在CD4-cre Rorcfl/fl小鼠中进行更多的研究，以评估E. lenta对结肠炎期间Rorc的CD4细胞特异性影响。

为了确定Th17激活在E. lenta物种中是否保守，我们用E. lenta 2243和另外3株基于遗传距离选择的菌株定殖GF小鼠，以考虑基因组的相似性和差异性。与E. lenta 2243相似，AB12在回肠Th17细胞呈增加趋势(图4A和4B)，其在结肠中的水平显著升高(图4C和4D)。相比之下，与GF相比，15644、1356和热灭活2243对Th17细胞没有显著影响(图4A-4D和S5B)。我们证实了SPF小鼠菌株水平的差异，与BHI和1356相比，2243处理的IL-17a GFP报告小鼠的Th17细胞显著升高(图S5C和S5D)。这些菌株水平的差异导致了结肠炎严重程度的显著差异(图4E-4H)。通过疾病评分、结肠长度和粪便脂质运载蛋白测定，与GF相比，2243单殖导致更严重的结肠炎，而1356单殖疾病指标没有差异，这与菌株在Th17诱导上的差异一致(图4E; 4H和S5F)。菌株之间的定殖水平相当(图S5A和图S5E)，表明这些差异是由宿主对这些菌株的反应造成的，而不是它们在胃肠道的定殖能力。

图4 Th17激活和结肠炎严重程度因E. lenta菌株而异。(A-D) GF小鼠或E. lenta 2243、15644、1356或AB12单殖小鼠在(A和B)回肠和(C和D)结肠固有层中活TCRβ+门IL-17a+ CD4+的代表性流式图和相对于无菌(GF)小鼠的差异倍数。数据来自2个独立实验(n=8-11)。(E-H) GF小鼠或用E. lenta 2243或1356单殖2周的小鼠用2% DSS处理，并(F)疾病追踪7天(n=8-10)。p值为双因素方差分析Sidak检验。(G)第7天的结肠长度。(H)通过ELISA测定结肠内容物中脂质运载蛋白水平。(G和H)相对于GF。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001; ****p＜0.0001；除非另有说明，否则采用单因素方差分析Tukey或Holm Sidak检验。显示平均值±SEM。每个点代表一只小鼠。模型图在BioRender.com绘制。参见图S2和S5以及数据S1和S2。

为了更广泛地评估E. lenta菌株之间免疫调节潜力的差异，我们转向体外Th17实验。与BHI处理相比，E. lenta 2243 CFS显著提高IL-17a水平，而1356和15644 CFS则没有(图S6A-S6C; 数据S3)。然后，我们对10株E. lenta菌株进行IL-17a诱导试验，与对照组相比，显示出有4株IL-17a诱导菌株和6株非诱导菌株(图5A)。使用ElenMatchR比较基因组学工具，我们确定了一个与Th17激活模式匹配的基因组位点(图5A)。这7个基因属于cgr相关基因簇(cac)(图5B)，cac是心脏药物地高辛和其他强心甾类药物代谢所必需的。此外，我们验证了用来自cac+和cac-菌株的CFS处理SPF小鼠在体内显示出相似的结果(图S6D和S6E)。这些结果表明，该位点的一个或多个基因也在形成宿主免疫中发挥作用。

既往研究表明，地高辛通过与Rorγt直接结合抑制Rorγt，导致Th17水平下降。我们假设，能够还原地高辛的酶Cgr2(在cac中发现)可以通过代谢培养基和胃肠道中尚未确认的底物来解除对Rorγt的抑制。这一假设的一个关键预测是，Cgr2应该足以促进IL-17a水平。我们使用的结构中，WT cgr2或cgr2部分功能缺失变体(Y333N)在硫链丝菌素诱导型启动子下在Rhodococcus erythropolis中表达。与未诱导或BHI对照相比，cgr2:WT的表达导致IL-17a水平显著增加(图5C)。cgr2:Y333N无显著影响(图5C)。这令人惊讶，因为携带Y333N突变(AB12和AB8)的天然E. lenta菌株诱导了IL-17a。我们的异源系统和天然菌株中cgr2 Y333N表达水平的差异可以解释这种差异。为了解决这个问题，我们转向体内系统，通过反复应用CFS来提高浓度。

为了测试cgr2是否足以在体内增加IL-17a水平，我们每隔一天用表达cgr2:WT或cgr2:Y333N +/-硫链丝菌素诱变剂的R. erythropolis CFS处理SPF小鼠，持续2周。与未诱导或BHI对照组相比，诱导cgr2:WT表达的R. erythropolis CFS导致Th17细胞显著增加(图5D和S6F-S5H)。部分功能缺失突变体cgr2:Y333N具有中间表型，与未诱导表达时相比，诱导表达时Th17水平增加，但程度低于cgr2:WT(图5D和S6F-S6H)。这些结果表明，肠道细菌酶Cgr2足以增加体内Th17的激活。

由于我们发现cgr2足以诱导Th17细胞，我们推测cgr2可能与Th17驱动的疾病(如RA和IBD)有关。在IBD数据集中，与对照组相比，cgr2在溃疡性结肠炎或克罗恩病患者中的流行率更高(图5E)。我们还想知道cgr2+ E. lenta是否与IBD疾病严重程度相关。在18例溃疡性结肠炎患者的粪便样本中，当检测到cgr2时，E. lenta水平与疾病评分显著相关；然而，当未被检测到cgr2时，没有显著的关联(图5F)。在cgr2+样品中，cgr2+ E. lenta菌株的比例为60%-100%(图5G)。我们还想确定cgr2水平是否在另一种自身免疫性疾病(如RA)中发生改变。与对照组相比，RA患者粪便中cgr2水平显著升高(图5H)。83%的RA患者样本检测到cgr2，而对照组检测到cgr2的比例为54%(图5I)。这些结果为这一特定细菌基因在人类自身免疫中的转化相关性提供了初步支持。

结果表明，Cgr2介导E. lenta-Th17的激活；然而，已知的Cgr2底物是药物和有毒植物所特有的，不应该出现在这些实验中。因此，我们试图找到其他Th17调节的Cgr2底物。我们用反相高效液相色谱(RPHPLC)分离3 kDa过滤BHI培养基cgr2+ E. lenta 2243和cgr2- 1356 CFS，然后在我们的Th17试验中检测IL-17a诱导性(图6A)。在第5部分可以看到IL-17a的差异诱导，这表明一个非极性的小分子起了作用(图6B)。为了鉴别潜在的Cgr2底物(Cgr2S)，我们对第5部分进行了液相色谱高分辨质谱(LCHRMS)分析。我们发现了2个m/z、963.5286(Cgr2S1)和848.4505(Cgr2S2)，BHI和1356显著高于2243，符合Cgr2底物的预期模式(图6C和6D;数据S4)。为了识别潜在的Cgr2代谢物(Cgr2M)，我们研究了2243中存在的化合物在BHI和1356中是否存在(图6C和6D)。由于Cgr2的还原酶能力，我们研究了2243独有的m/z，其中2的位移与还原事件一致；然而，没有发现任何适合这两种底物模式的特征。

接下来，我们使用基于特征的分子网络分析(FBMN)来注释假定的Cgr2底物。Cgr2S1被预测为甾体皂苷(图6E)，其在BHI和1356中的强度明显高于2243(图6F)。Cgr2S2未注释。Cgr2将化学结构上相似的强心苷和强心甾(包括Th17-抑制性地高辛)代谢成一种较弱的抑制剂。综上所述，这些结果支持了cgr2+ E. lenta将内源性Th17抑制性甾体皂苷代谢为较弱的抑制剂，从而导致Th17激活和恶化结肠炎的假设。需要做更多的工作来完全纯化和解决每一个假定的Cgr2底物和代谢物的结构，以便对Th17激活进行更多的对照研究。

而我们的发现表明，Cgr2代谢培养基中存在的Th17抑制性甾体皂苷；这些化合物在人类自身免疫中的转化相关性尚不清楚。为了解决这个问题，我们使用了来自PRISM的代谢组学数据集。在7种甾体皂苷中，有3种在IBD状态下显著减少，并且/或与粪便中钙卫蛋白水平呈负相关(图6G-6J)。虽然我们没有发现与Cgr2S1或Cgr2S2的m/z精确匹配，但这些发现表明，甾体皂苷在人体中存在，在疾病状态下存在差异，并且与疾病严重程度指标呈负相关。由于甾体皂苷对人类疾病的重要性，它将是未来研究的一个激动人心的领域。

 图6 cgr2+ E. lenta代谢Th17调节因子的特征。(A和B) 使用RP-HPLC对BHI培养基对照、cgr2+ E. lenta 2243和cgr2- 1356 3 kDa过滤的无细胞上清(CFS)进行分离用于Th17实验。用LCHRMS分析差异活性组分。(B) BHI、2243和1356 CFS的RP-HPLC馏分2-6用于Th17倾斜细胞。通过ELISA评估IL-17a水平的差异倍数(相对于未处理)。p值为单因素方差分析Holm Sidak检验。(C和D)对BHI、2243和1356 CFS的RP-HPLC馏分5进行LCHRMS。前50差异丰富的特征(通过p值，单因素方差分析)Z得分显示在层次聚类热图中。(D)假定的Cgr2底物(Cgr2S1-2)和假定的Cgr2M1-15的Log2差异倍数(n=4/组)。(E)基于特征的Cgr2S1-m/z 963.5286分子网络分析(黄色)，其属于脂类/类脂分子，甾体皂苷簇(Cgr2S1的甾体皂苷父类分配余弦值为0.3889)(F) RP-HPLC馏分5的LCHRMS分析中Cgr2S1 - m/z 963.5286的强度值。p值为单因素方差分析Holm Sidak检验。(G)PRISM和NLIBD/LLDeep IBD研究中相对于对照的甾体皂苷(1:HILIC-pos_Cluster_1532，2:C8-pos_Cluster_0588，3: HILIC-pos_Cluster_1531)的差异倍数。克罗恩病(88例)，溃疡性结肠炎(76例)和对照组(56例)。(H-J) PRISM和NLIBD/LLDeep IBD研究中甾体苷相对丰度与粪便钙卫蛋白水平的相关性(mg/g)。Spearman rho，p值列出。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001; ****p＜0.0001。数据显示为热图，Tukey box和whisker plots，单个点，或平均值±SEM。模型图在BioRender.com绘制。参见数据S4。

鉴于E. lenta和cgr2在多种自身免疫性疾病中的临床相关性，我们试图找到一种非侵入性的策略来阻断这种代谢活动，而不深入干扰肠道微生物群。我们利用先前的数据表明，膳食蛋白质摄入量可能是由于肠道内精氨酸(Arg)水平的增加，阻碍了心脏药物地高辛Cgr2的降低。我们推测，Arg的升高可能具有类似的能力阻止cgr2+ E. lenta介导的Th17激活和相关的疾病表型。

我们设计了两种不同Arg水平的配方饲料：每千克1%或3%(表S2)。在cgr2+ E. lenta 2243或cgr2- 15644定殖GF小鼠前，分别饲喂1%或3%精氨酸饲料3天，连续2周(图7A;表S2)。与GF或15644定殖小鼠相比，1% Arg饲粮下2243定殖小鼠的Th17细胞显著增加(图7B和7C)，这是基于cgr2状态的预期结果。食用3% Arg饲粮降低了这一影响，显著降低了2243单殖小鼠的Th17水平(图7B和7C)。E. lenta在不同饲粮中的定殖水平没有差异(图S7A)，这表明免疫功能的差异是由膳食依赖性的细菌代谢变化驱动的，而非定殖效率。

最后，我们测试了饲粮Arg是否能够降低E. lenta对结肠炎严重程度的影响。我们将cgr2+ E. lenta 2243或cgr2- 15644灌喂SPF小鼠，并喂食1%或3% Arg饲粮2周，然后DSS诱导结肠炎(图7D)。Th17细胞水平与我们之前的实验一致(图S7B和S7C)，且在1% Arg饲粮中，唯一严重程度升高的组是cgr2+ 2243(图7E-7G)，这强调了饲粮环境和菌株水平变化对确定宿主免疫和疾病表型方面的重要性。

 图7 饲粮精氨酸抑制cgr2+ E. lenta对Th17的激活和结肠炎的诱导。(A-C) 分析喂食1%或3%精氨酸(Arg)饲粮的无菌(GF)、E. lenta 2243和15644单殖小鼠的Th17细胞水平。(B)代表性流式图和(C)回肠固有层活CD3+ 中CD4+ IL-17a+细胞相对于GF 1% Arg的差异倍数。数据来自2个独立实验(n=8-11)。(D-G) SPF小鼠在1%或3% Arg饲粮下分别灌胃BHI、2243和15644，2周后再加2% DSS。(E) 7天以上的疾病评分。p值为双因素方差分析Sidak检验(1% vs 3% 2243)(n=5-10)。(F)相对结肠长度。(G)结肠中脂质运载蛋白的相对含量。(F和G)中水平相对于BHI控制膳食组。数据来自2个独立实验。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001; ****p＜0.0001。除非另有说明，否则采用单因素方差分析Tukey检验。显示平均值±SEM。每个点代表一只小鼠。模型图在BioRender.com绘制。参见图S2和S7。

我们的结果为人类肠道中普遍存在的放线菌(E. lenta)在许多自身免疫性疾病中的作用提供了证据。此前，对E. lenta的研究主要集中在其在菌血症中的作用，但近年来，E. lenta与MS和RA的关系越来越密切。我们的结果表明，E. lenta在IBD患者中也富集，并使结肠炎模型恶化。此外，我们还鉴定了一个必要的基因簇cac，并且在该基因簇中还鉴定出一个特定的基因cgr2，cgr2可激活小鼠Th17，并与人类疾病相关。最近发表的关于另外两种自身免疫性疾病的研究支持了E. lenta和cgr2在自身免疫中的广泛相关性，其中cgr2+ E. lenta在疾病状态下富集。

由于这种肠道细菌对Th17细胞的影响，加上缺乏抗原特异性，E. lenta对不同疾病状态产生广泛影响的潜力增加了。我们的发现不同于之前对细菌和真菌的研究，之前的研究认为细菌和真菌涉及特定的抗原和/或需要上皮粘附。相比之下，E. lenta对Th17细胞分化后的作用是远距离的。这些发现提高了对肠道外其他组织Th17细胞的影响，或与之前描述的抗原特异性反应协同作用的可能性。

我们的工作还表明，需要进一步研究内源性甾体皂苷的免疫调节作用以及它们在宿主和微生物酶代谢中的全面程度。先前的研究表明，强心苷地高辛抑制Rorγt可降低自身免疫模型的严重程度。我们的研究表明，在细菌培养基中存在的甾体皂苷被E. lenta的Cgr2酶代谢，进而对免疫激活产生下游影响。然而，还需要进行更多的工作来纯化和解答本研究鉴定出的假定的Cgr2底物和代谢产物的结构，以便进行深入的生化、免疫学和微生物特征分析。确定这些化合物的来源以及控制其在小鼠和人类体内浓度的因素也很重要。

膳食是微生物群和微生物介导免疫调节的关键调控因子。我们的研究结果表明，膳食中Arg水平可用于调节cgr2+ E. lenta定殖对象的Th17活性。由于膳食Arg不依赖E. lenta的免疫调节活性，其潜在的脱靶效应可能会使利用膳食以有益的方式调节免疫反应的目标复杂化。尽管如此，多项观察结果支持Arg对IBD的普遍有益作用。IBD患者结肠组织Arg水平与疾病活动指数呈显著负相关，补充Arg可改善DSS结肠炎结果。结合之前的工作，我们的研究扩展了膳食改变微生物免疫调节代谢物的一般机制，证明了膳食改变微生物免疫调节的可行性。

虽然我们的发现提供了一种令人信服的E. lenta菌株选择与疾病之间的联系，但需要更多的工作将这些观察结果放在更广泛的背景下，了解这种细菌物种的全部代谢能力，更不用说肠道微生物群的其余部分。我们的合作者已经证明E. lenta可以通过胆汁酸羟类固醇脱氢酶产生对Th17激活具有相反作用的代谢物，如3-氧-石胆酸(LCA)和isoLCA。这些结果，连同目前的研究，强调了单一菌株(如DSM 2243)的代谢能力，激活和抑制Th17细胞的潜力。这些机制之间的平衡需要更复杂的模型，可能涉及到与胆汁酸代谢所必需的其他细菌的相互作用。

总之，这些结果扩展了细菌形成黏膜免疫的机制，为人类肠道细菌代谢在驱动自身免疫中的作用提供了支持。需要进一步研究Th17调节Cgr2底物的范围、结构，以及特异性免疫调节化合物的微生物代谢对疾病的直接影响。这项工作的另一个重要的未来研究方向是用针对E. lenta的抗生素调节人体的E. lenta水平和/或代谢活性，或改变膳食对自身免疫患者的E. lenta代谢是否有功能性影响。