右美托咪定抑制星形胶质细胞和细胞焦亡并随后在脓毒症的体外和体内模型中保护大脑

摘要

脓毒症会危及生命，通常会导致急性脑损伤。右美托咪定是一种α2-肾上腺素能受体激动剂。据报道对各种脑损伤具有神经保护作用，但潜在的机制仍然难以捉摸。在这研究，使用脓毒症的体外和体内模型来探索右美托咪定对炎症小体的影响活性及其相关的胶质细胞焦亡和神经元死亡。在体外，炎症小体激活和细胞焦亡是在脂多糖(LPS)暴露后在星形胶质细胞中发现。右美托咪定显着减轻星形胶质细胞LPS诱导的细胞焦亡和抑制组蛋白释放。在体内，大鼠的LPS治疗促进了caspase-1星形胶质细胞的免疫反应性并导致IL-1β和IL-18促炎细胞因子的释放增加，导致神经元损伤，被右美托咪定减轻；这种神经保护作用被α2-肾上腺素能受体拮抗剂阿替美唑。右美托咪定显着降低LPS引起的高死亡率挑战。我们的数据表明，右美托咪定可以通过减少细胞焦亡来保护神经胶质细胞，随后保护神经元，所有这些都可以保护大脑功能并最终改善脓毒症的结果。

绪论

脓毒症，一种严重的全身炎症反应感染的结果，与高发病率和死亡率。这是最常见的原因入住重症监护室，是其中之一死亡的主要原因。脓毒症引起的脑损伤发生在危重病人脓毒症的早期，并有助于脓毒症的进展。脓毒症脑损伤患者常有变化，在精神状态下，从谵妄到昏迷，伴有意识、认知和知觉异常水平的改变。尸检分析表明，脓毒症引起的脑损伤的病理生理学通常显示弥漫性脑微脓肿，表明该损伤可能与细菌和/或内毒素直接侵入大脑有关。越来越多的证据表明这个过程涉及炎症作为导致中枢神经系统(CNS)功能障碍的机制，神经炎症和相关的兴奋性毒性参与了脓毒症引起的神经功能障碍的病理过程。此外，星形胶质细胞在为神经元提供功能支持和调节与相邻神经元通过胶质传递、突触可塑性、间隙连接和能量代谢支持。此外，星形胶质细胞通过释放促炎细胞因子和毒性分子参与与神经炎症相关的脑损伤，而星形胶质细胞的激活对脑损伤及神经元功能产生不利影响，并可能导致有害的神经后遗症。因此，星形胶质细胞的保护可能是针对脓毒症诱导的脑损伤的潜在治疗靶点。

右美托咪定是一种α2-肾上腺素能受体激动剂，广泛用于重症监护病房危重症患者围手术期镇静、镇痛、和焦虑症。先前的一项研究表明，接受右美托咪定治疗的患者的无呼吸机小时数比安慰剂治疗组多。甚至有人提出强烈选择右美托咪定而不是苯二氮卓类药物。推荐用于预防危重病人谵妄患者。最近的证据还表明，右美托咪定可使老年人的生存期延长至2年入住ICU的患者，以及改善3年幸存者的认知功能和生活质量。此外，在各种体外和体内模型中，已经报道了右美托咪定对脑和外周组织中的细胞凋亡、坏死和自噬的保护作用。已显示右美地托咪定可通过抑制细胞凋亡和促进细胞存活来提供针对胆红素诱导的肺损伤的保护。此外，右美托咪定介导的脑保护作用缺血再灌注损伤引起的损伤证明，这被认为是由自噬抑制介导的。然而，右美托咪定是否可以抑制脓毒症中中枢神经系统的细胞焦亡仍然未知。

细胞焦亡是细胞死亡的促炎形式和坏死的调节形式，不同于其他与炎症小体激活相关的细胞死亡形式。炎性体作为传感器检测入侵的病原体和细胞损伤危险信号，并诱导强效促炎细胞因子的过度产生，从而加剧炎症介导的器官损伤。发生细胞焦亡的细胞会经历细胞肿胀、膜快速破裂、DNA断裂和细胞内内容物的外渗，从而对相邻的健康细胞产生毒性并导致进一步的细胞死亡。细胞焦亡可以由各种病理刺激触发，例如微生物感染和缺血再灌注。越来越多的证据表明，这种新型细胞死亡可能在中枢神经系统疾病的发病机制中起关键作用，包括阿尔茨海默病和多种硬化症，其特征是神经元损伤和神经炎症。此外，已经发现中枢神经系统中的一系列细胞类型可能会发生炎症小体诱导的细胞焦亡。这些细胞，包括小胶质细胞和星形胶质细胞，表现出NLRP3炎症小体相关反应，这可能是负责神经功能的恶化。研究表明，右美托咪定可以通过以下方式减轻炎症反应减少肝脏和胰腺中炎症小体的激活；然而，右美托咪定的抗炎作用与脓毒症引起的脑损伤中的细胞焦亡相关需要进一步研究。在这项研究中，我们开始评估假设右美托咪定可通过抑制脓毒症体外和体内模型中的胶质细胞焦亡来保护大脑。

结果

LPS而不是TNF-α可以诱导培养的星形胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活和焦亡

为探索致病介质的细胞毒性，在脓毒症中，将1321N1星形胶质细胞分别用LPS或TNF-α作为外在和内在介质进行培养，然后进行碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术评估。LPS和TNF-α均引起细胞以剂量依赖性方式死亡(P<0.01)(图1a-d)。此外，还评估了细胞焦亡相关蛋白。作为在蛋白质印迹分析中显示，LPS处理刺激了NLRP3(核苷酸结合域，富含亮氨酸重复序列的蛋白质3)、ASC的上调(含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白)、caspase-1和GSDMD(gasderminD)表达(P<0.01，图1e，g)。这些蛋白质在TNF-α培养的星形胶质细胞中没有增加(P>0.05，图1f，h)，表明LPS发生了caspase-1激活和细胞焦亡，但没有TNF诱导的星形胶质细胞死亡。

右美托咪定可减轻脂多糖诱导的培养星形胶质细胞焦亡

发现右美托咪定对LPS诱导的细胞焦亡具有细胞保护作用(图2)。星形胶质细胞处理与LPS组相比，右美托咪定显示PI阳性细胞显着减少34%(P<0.01，图2a、b)。暴露于LPS后，ASC和caspase-1共定位的表达在培养的星形胶质细胞中很明显。此外，ASC蛋白从细胞核到细胞质的重新分布表明炎症小体激活，而右美托咪定治疗导致星形胶质细胞恢复到类似于天然的对照组(图2c)。此外，右美托咪定将NLRP3的表达显着降低25%(P<0.05，图2e)，ASC降低32%( P<0.05，图2f)，caspase-1的表达降低34%(P<0.01，图2g)，和GSDMD相对于对照增加30%( P<0.01，图2h)。总之，这些发现表明右美托咪定改善NLRP3炎症小体募集和caspase-1激活，以及减少LPS诱导的星形胶质细胞的损伤。

右美托咪定可降低培养星形胶质细胞脂多糖暴露后组蛋白的释放

在细胞损伤期间，细胞核蛋白组蛋白可以从垂死的细胞释放到细胞外空间，从而增强对细胞成分的破坏。在用LPS攻击星形胶质细胞后，检测到细胞质中的高水平组蛋白，与对照相比，细胞骨架结构的分布更加混乱。用右美托咪定治疗，组蛋白在很大程度上被限制在细胞核内，细胞整体结构也得以保留(P<0.01，图3a-c)。与未处理的细胞相比，LPS处理的细胞培养基中组蛋白的定量显示组蛋白的释放显着增加；右美托咪定在LPS攻击后显着抑制组蛋白释放(P<0.01，图3d)。这些结果表明右美托咪定可防止质膜破裂并维持细胞形态。

重组组蛋白诱导培养的神经元样细胞的神经毒性

细胞外组蛋白具有细胞毒性，可能会在特定类型的细胞死亡过程中损害周围环境过程，包括焦亡。为了评估内源性产生的组蛋白的作用及其对周围神经元的影响，我们使用了外源性组蛋白到PC12细胞。如图4所示，组蛋白介导的毒性通过Hoechst33342和PI的双荧光染色进行评估。活细胞数(Hoechst确定了33342正常/PI阴性)、凋亡细胞(Hoechst 33342阳性/PI阴性)和坏死细胞(PI阳性)(图4a)。Hoechst和PI染色显示组蛋白处理后的细胞死亡呈剂量依赖性(P<0.01，图4c)。PC12细胞的形态模式在组蛋白刺激后发生显着变化(图4b)。与对照组相比，细胞表现出小而圆的细胞体和短的树枝状结构，显示出长的远端树枝状结构。因此，在低剂量和高剂量组蛋白给药后，组蛋白都能引起神经元样细胞损伤。

右美托咪定介导脓毒症大鼠对星形胶质细胞焦亡和神经炎症的神经保护

为了进一步证实我们的体外发现，还在体内检查了右美托咪定对脑保护的影响。对caspase-1/GFAP进行双重免疫荧光染色。LPS处理增加caspase-1活化的表达并导致脓毒症大鼠海马中caspase-1与GFAP阳性细胞的共定位，当与未经处理的动物相比。相反，与LPS组相比，右美托咪定组的星形胶质细胞中caspase-1活化的表达较弱(5.8±1.3%vs.9.1±1.8%，p<0.01，图5a、b)。α2-肾上腺素受体拮抗剂阿替美唑阻断了右美托咪定诱导的caspase-1/GFAP降低表达的作用(8.9±1.8%vs.5.8±1.3%，P<0.01，图5a,b)。IL-1β、IL-18和他的音调分泌也在大鼠的海马区进行了测定，在LPS组与对照组相比。右美托咪定可显着降低细胞焦亡相关细胞因子IL-1β的产生(110.19±24.12与164.38±35.32，P<0.01，图5c)和IL-18(35.25±8.67与47.22±9.26，P<0.05，图5d)。

组蛋白浓度的降低表明给予右美托咪定后组蛋白释放减弱(0.07±0.01vs.0.1±0.02，P<0.01，图5e)。海马神经元细胞损伤由组织切片中的caspase-3/NeuN免疫染色确定。与对照组相比，在LPS攻击的大鼠中还观察到caspase-3的积累增加和caspase-3阳性神经元细胞(NeuN阳性细胞)的数量增加。神经保护作用右美托咪定是通过抑制caspase-3/NeuN表达(16.4±4.0%与27.2±3.7%，P<0.01，图6a、b)而发现的，而阿替美唑消除了由右旋美托咪定介导的caspase-3/NeuN表达下调(24.3±3.2%与16.4±4.0%，P<0.01，图6a,b)。总的来说，这些发现表明右美托咪定治疗可减少神经炎症、细胞焦亡相关的神经元脑损伤脓毒症模型中的损伤和组蛋白释放(图6c)。右美托咪定可提高脓毒症大鼠的存活率在72小时的实验持续时间内，大鼠表现出严重的脓毒症行为，并且注射LPS后死亡率很高。与LPS治疗组相比，右美托咪定显着提高了存活率组(72.22%对33.33%，P=0.0125，图7)。阿替美唑降低右美托咪定的保护作用(38.89%对72.22%，P=0.0362，图7)。

讨论

研究表明，右美托咪定在各种疾病模型中表现出神经保护作用；然而，右旋美托咪定对一种新形式的细胞死亡、细胞焦亡的神经保护作用，在脓毒症引起的脑损伤尚不清楚。在本研究中，我们证明右美托咪定作用于大脑体外脓毒症模型中的保护和体内。右美托咪定通过以下方式保护大脑/神经元改善星形胶质细胞焦亡和有害神经元LPS攻击后的炎症和存活率提高。其神经保护作用被α2-肾上腺素受体拮抗剂，表明右美地托咪定可能通过α2-肾上腺素受体激活提供神经保护。

在脓毒症期间，先天免疫细胞被称为病原体相关分子模式(PAMP)分子的外来分子产物激活，导致炎症细胞的激活和促炎细胞因子的增加。此外，脓毒症中涉及各种形式的细胞死亡。在这项研究中，我们选择LPS和TNF-α作为革兰氏阴性菌产生的内毒素的典型例子，并且是促炎细胞因子释放的主要介质脓毒症，分别。我们发现两者都能够导致星形胶质细胞死亡。然而，在LPS组中观察到炎性体激活和GSDMD裂解，而它们都没有出现对TNF-α的反应，表明在细胞死亡过程中LPS而不是TNF-α刺激诱导星形胶质细胞焦亡。

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的炎症形式，受到多种病原体的刺激。在炎性小体激活的驱动下，细胞焦亡可能导致脓毒症和败血性休克的发展。在细胞焦亡期间，炎症小体复合物被激活和组装，促进caspase-1激活。随后，炎性半胱天冬酶促进裂解gasderminD(GSDMD)蛋白，其诱导质膜中的孔形成，导致细胞焦亡诱导的裂解细胞死亡。在炎症小体复合物中，NLRP3炎症小体是最常被表征的，并在CNS中发挥了关键作用。NLRP3炎症小体复合体是在招募ASC后形成的，并且pro-caspase-1，导致炎症小体激活和焦亡的开始。此外，细胞焦亡与多种神经系统疾病的发病机制有关，包括阿尔茨海默病、创伤性脑损伤和癫痫。

星形胶质细胞培养物的活化增加与LPS。在NLRP3炎性体组装和激活其下游信号通路，我们观察到星形胶质细胞肿胀和LPS治疗后GSDMD裂解显着增加，因此确认了细胞焦亡途径的激活。细胞焦亡的特征之一是细胞膜中的孔形成，这可以由GSDMD裂解诱导，导致质膜破裂并释放包括核内蛋白在内的胞质细胞内容物。组蛋白是核内蛋白质，可为核染色质提供结构稳定性并调节基因转录。此外，组蛋白可能会因死亡而释放到细胞外空间细胞，特别是在坏死后，包括坏死性凋亡、细胞焦亡和铁死亡，并作为损伤相关分子模式(DAMP)分子导致对周围细胞的进一步细胞毒性。这个该过程与脓毒症、器官损伤和神经退行性疾病有关。已证明细胞外组蛋白释放的毒性作用会导致内皮功能障碍、器官衰竭和死亡脓毒症期间。小鼠中LPS诱导的急性肾损伤部分涉及细胞外组蛋白，正如观察到的组蛋白中和抗体可预防肾功能障碍所表明的那样。外源性组蛋白给药增加脑梗塞体积，而抗H2A/H4抗体减少损伤，表明可能的不利影响缺血性中风中的细胞外组蛋白。我们的数据表明，LPS处理后可检测到组蛋白重新定位和释放，而右美托咪定将组蛋白限制在细胞核内并减少细胞外空间中的组蛋白。此外，外源组蛋白导致神经元丢失，因此表明右美托咪定进一步间接保护神经元免受与细胞外组蛋白相关的细胞毒性。这些数据表明组蛋白的释放可能在LPS诱导的细胞焦亡中加剧，这与先前的发现一致，这些发现表明在某些形式的细胞死亡(包括细胞焦亡)后，组蛋白存在于周围的细胞外环境中。右美托咪定可通过在此过程中减少细胞毒性细胞外组蛋白的释放来发挥其神经保护作用。

在本研究中，我们发现右美托咪定增加细胞存活，并在LPS诱导的星形胶质细胞焦亡细胞死亡中抑制炎性体激活和GSDMD增加，表明右美托咪定参与改善星形胶质细胞焦亡。这与最近的一项发现一致，即右美托咪定减弱蛛网膜下腔出血相关的大脑通过抑制NLRP3炎性体通路来减轻损伤。尽管右美托咪定保护的神经元已在各种脑损伤模型中得到很好的证明，但尚未报道其对星形胶质细胞的保护作用。星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的重要免疫成分，参与突触可塑性和信息在神经元电路中处理。它们发挥代谢作用并为神经元提供结构支持，同时也在调节神经元稳态和更高的神经元功能。星形胶质细胞和神经元之间的相互作用在多种神经系统疾病的发展和进展中起着至关重要的作用。星形胶质细胞生理功能的改变会导致基本的神经支持和神经保护功能的丧失，从而导致多种脑部疾病。小胶质细胞作为CNS中第二丰富的神经胶质细胞类型，在病理刺激下被快速激活，例如LPS，进而在CNS内释放各种促炎介质，导致高度“易燃”的炎症状态。此外，小胶质细胞比星形胶质细胞更早被激活并促进星形胶质细胞的激活。随后，活化的星形胶质细胞反过来调节小胶质细胞的活动并促进远处小胶质细胞的激活。它们最终相互“合作率”，并在脓毒症等病理条件下增强炎症反应引起神经炎症，最终导致神经元损伤和脑功能障碍。此外，先前的研究表明，过度活化的星形胶质细胞本身最终会在受到不同损伤的情况下发生细胞死亡，而这些星形胶质细胞无法提供其稳态功能并保护神经元；所有这些都为发展做出了贡献。有害的神经系统后遗症。

因此，作为作为CNS防御的第一道防线，保护星形胶质细胞免受病理损伤以进一步保护神经中心脑功能非常重要。此外，外周LPS给药可能会触发炎症小体激活和大脑内炎症介质的产生。研究表明，神经炎症相关脑部疾病的发展与caspase-1的显着增加有关。Caspase-1是细胞焦亡的核心特征，在焦亡期间被激活，启动成熟的IL-1β的释放和IL-18。IL-1β和IL-18的长期升高会导致神经毒性；和高浓度的IL-1β和IL-18已在CNS感染患者的脑脊液(CSF)和脑组织中得到证实，脑损伤和神经退行性疾病。在这项研究中，我们观察到星形胶质细胞中caspase-1免疫无反应性水平升高，以及大脑中IL-1β和IL-18释放和组蛋白生成增加脓毒症大鼠。此外，在LPS给药后观察到神经元损伤，表明细胞焦亡可能在神经炎症和脓毒症诱导的脑损伤的发展中起重要作用，而受损的星形胶质细胞未能有效地提供神经元支持。右美托咪定消除了上述有害变化并保护了神经胶质和神经元，最终保留了大脑功能本身。事实上，它在ICU中用于脓毒症患者时减少了昏迷时间。

值得一提的是，除了减轻炎症和保护神经胶质细胞和神经元外，如上所述，右美托咪定对器官的保护作用，特别是对脑、肾和肺的保护，先前已有详细记录。此外，右美托咪定可促进自然睡眠，而自然睡眠对维持生理稳态很重要包括保持免疫功能和恢复身体能量和修复潜在的内在损伤。由于右美托咪定的上述所有但不限于有利作用，它有效地降低了死亡率由当前研究中发现的LPS诱发，这与我们之前的报告一致。

尽管我们实验中使用的右美托咪定浓度之前已多次报道，但不可否认，实验室研究与临床实践仍有差距。已经显示静脉输注后，人血浆中右美托咪定的治疗浓度可高达1µM。据报道，25µg/kg右美托咪定具有显着的神经保护作用对异氟醚引起的年轻人损伤的作用。这些工作可以说为我们分别为我们的体外和体内研究选择的右美托咪定剂量提供了基础。但是，必须承认右美托咪定的剂量远高于临床使用的剂量。曾经可以理解的是，一般用于动物的药物通常比用于人类的药物高7-10倍。

总的来说，据我们承认，这项研究首次证明，右美托咪定可以在脓毒症诱导的脑损伤中防止焦亡。这些数据表明，右美托咪定可能通过抑制星形胶质细胞焦亡来提高神经元存活，从而减少脑内潜在的有害焦亡相关炎症反应，提示右美托咪定在脓毒症诱导的脑损伤中存在一种新的神经保护机制。

图1在培养的星形胶质细胞中，由LPS而非TNF-α诱导的NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡。1321N1细胞用LPS(1–100ng/ml) a、b或TNF-α(1–100ng/ml) c、d处理24小时。1321N1死细胞的百分比通过碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术分析来测量。在LPS e、g或TNF-α f、h存在下对NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1-p20、GSDMD、GSDMD-N进行蛋白质印迹分析。数据表示为平均值±标准差(n=6)。**P<0.01，与对照组相比。

图2右美托咪定介导的细胞保护作用，防止星形胶质细胞中LPS诱导的细胞焦亡。1321N1细胞用右美托咪定(1µM)处理30分钟，然后补充LPS(100ng/ml)。a,b 1321N1细胞死亡的百分比，由丙锭测量碘化物(PI)染色，然后进行流式细胞术分析。c使用caspase-1(绿色)和ASC(红色)进行双重免疫荧光标记。细胞核用DAPI复染。d-hNLRP3、ASC、caspase-1前体、caspase-1-p20、GSDMD、GSDMD-N的表达，通过蛋白质印迹确定。规模条形：10µm。数据表示为平均值±标准差(n=6)。**P<0.01，与对照组相比；#P<0.05，##P<0.01，与LPS组相比。

图3右美托咪定抑制脂多糖暴露后星形胶质细胞组蛋白释放和细胞骨架破坏。1321N1细胞经右美托咪定(1µM)处理30min后LPS刺激。a双免疫荧光标记组蛋白H4(绿色)和f-肌动蛋白(红色)。DAPI复染细胞核。1321N1细胞b组蛋白胞质易位和c细胞骨架失序的百分比。d处理后星形胶质细胞培养液中组蛋白H4的浓度。比例尺:10µm。数据以均数±标准差表示(n=6)。与对照组相比，**P<0.01;与LPS组相比，P<0.01。

图5右美托咪定降低了脓毒症大鼠星形胶质细胞的caspase-1活性和细胞焦亡相关的炎症反应。脑在不存在或存在右美托咪定或与α2-肾上腺素能受体组合的情况下，在LPS给药后24小时收集样品拮抗剂，阿替美唑。a,b双免疫荧光标记与胶质纤维酸性蛋白(GFAP，绿色)和caspase-1(红色)在海马体。细胞核用DAPI复染。c-e IL-1β、IL-18、组蛋白H4的浓度，通过ELISA测量。比例尺：50µm。数据是表示为平均值±标准差 (n=6)。**P<0.01，与对照组相比；#P<0.05和##P<0.01，与LPS组相比；^^P<0.01，对比LPS+Dex组。

图6右美托咪定减少了脓毒症大鼠的神经元损伤。在有或没有LPS给药后24小时收集脑样本右美托咪定或与α2-肾上腺素能受体拮抗剂阿替美唑合用。a,b双免疫荧光标记神经元核(NeuN，绿色)和caspase-3(红色)在大鼠海马中。细胞核用DAPI复染。比例尺：50µm。数据表示为平均值±标准差(n=6)。** P <0.01，与对照组相比；##P<0.01，与LPS组相比；^^P <0.01，与LPS+Dex组相比。c右美托咪定抑制脓毒症所致脑损伤中细胞焦亡的拟议机制。右美托咪定在脓毒症期间抑制星形胶质细胞焦亡。同时与细胞焦亡有关，在细胞死亡过程中，右美托咪定抑制炎症和毒性分子。右美托咪定通过减轻星形胶质细胞焦亡进一步保护神经元损伤。

图7右美托咪定提高了脓毒症大鼠的存活率。LPS给药后72小时内的存活率分析通过Kaplan-Meier对数秩检验(n=12-18)。**P<0.01，相对于控制组;#P<0.05，与LPS组相比；^P<0.05，与LPS+德克斯组对比。