陈皮提取物可降低小鼠对HFD诱导的糖脂代谢紊乱的易感性

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

背景：研究表明，生命早期抗生素暴露导致的小鼠肠道微生物失调，会促进成年小鼠糖脂代谢紊乱。但其机制尚不清楚，目前尚无有效的干预或治疗方法。

目的：本研究调查了小鼠生命早期阿奇霉素(AZT)暴露是否会促进成年期高脂饮食(HFD)诱导的糖脂代谢紊乱。此外，还研究了陈皮(CRP)提取物通过调节生命早期暴露于抗体的小鼠肠道微生物群对糖脂代谢紊乱的影响。

方法与结果：三周龄小鼠经饮水给药AZT(50 mg/kg/day)处理2周，然后喂食CRP饮食(1% CRP提取物)4周，喂食HFD 5周。结果表明，生命早期AZT暴露可促进HFD诱导的糖脂代谢紊乱，增加炎症因子水平，促进菌群代谢产物氧化三甲胺(TMAO)的产生，并引起成年小鼠的微生物失调。重要的是，CRP提取物可减轻这些影响。

结论：综上所述，这些发现表明，生命早期AZT暴露会增加成年小鼠对HFD诱导的糖脂代谢紊乱的易感性，而CRP提取物可以通过调节肠道微生物群来降低这种易感性。

图文摘要 陈皮提取物可调节AZT诱导的幼年小鼠肠道微生物失调，降低成年小鼠HFD喂养下的菌群代谢产物TMAO水平，从而降低炎症水平，改善糖脂代谢。    

论文ID

原名：Citrus reticulatae pericarpium Extract Decreases the Susceptibility to HFD-Induced Glycolipid Metabolism Disorder in Mice Exposed to Azithromycin in Early Life 

译名：陈皮提取物可降低生命早期暴露于阿奇霉素的小鼠对HFD诱导的糖脂代谢紊乱的易感性

期刊：Frontiers in Immunology

IF：7.561

发表时间：2021.11.19

通讯作者：赵晓山＆娄林洁

通讯作者单位：南方医科大学珠江医院中医科；温州医科大学附属第一医院

DOI号：10.3389/fimmu.2021.774433 

实验设计

图1 实验流程图。 43只3周龄小鼠在饮水中分别给药或不给药AZT处理2周，随后分别喂食或不喂食CRP饮食4周，然后再喂食ND或HFD5周。

结果

1 UPLC-Q/TOF MS分析RP

如图2所示，根据CRP提取物的保留时间，共鉴定出7种成分(表S2)。

图2 CRP提取物的高效液相色谱分析。(1)柚皮苷-4-O-葡萄糖苷，(2)芸香柚皮苷，(3)柚皮苷，(4)橙皮苷，(5)枸橘甙，(6)川陈皮素，(7)橘皮素。

  2 CRP提取物可降低HFD诱导的生命早期AZT暴露小鼠的体重

如预期的那样，试验第6周前各组间体重无显著差异；在实验第7周观察到差异(图3A,B)。试验结束时，HFD组的体重和脂肪组织/体重比显著高于对照组(Ctrl)。值得注意的是，与HFD组相比，AZT组体重和脂肪组织/体重比显著增加，而CRP显著缓解了体重和脂肪组织/体重比的增加(图3C,D)。但各组间肝脏/体重比无显著差异(图3E)。组织形态学分析表明，与对照组相比，HFD组小鼠肝脏脂肪变性更严重，脂肪细胞体积更大。与HFD组相比，AZT组小鼠肝脏脂肪变性更严重，脂肪细胞更大，而CRP组的这些组织形态学改变得到了改善(图3F,G)。这些结果表明，CRP提取物可减轻AZT处理的HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠的体重，并改善糖脂代谢紊乱。

图3 组间的表型变化。(A)实验过程中体重的变化。(B)九周龄小鼠体重的变化。(C) 14周龄小鼠体重的变化。(D)脂肪组织/体重比。(E)肝脏/体重比。(F)肝脏H&E染色。(G)脂肪组织H&E染色。(200×，比例尺：100 μm)。采用方差分析评估差异。数据以平均值±SEM表示，每组n=10；*P < 0.05。

  3 CRP提取物改善了HFD诱导的生命早期AZT暴露小鼠的糖脂代谢

正如所预期的那样，与对照组相比，HFD组的葡萄糖耐量增加。更重要的是，与HFD组相比，AZT组葡萄糖耐量增加，CRP饮食恢复了AZT处理小鼠的葡萄糖耐量(图4A,B)。此外，与对照组相比，HFD组血清TG、TC、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低。AZT组脂质代谢紊乱进一步加剧，CRP饮食改善了AZT处理小鼠的脂质代谢紊乱(图4C-F)。这些结果表明，CRP提取物可改善AZT处理的HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠的糖脂代谢。

图4 各组的糖脂代谢指标。(A) OGTT曲线。(B) OGTT曲线下面积(AUC)。(C)血清甘油三酯(TG)。(D)血清总胆固醇(TC)。(E)血清低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)。(F)血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)。采用方差分析评估差异。数据以平均值±SEM表示，每组n=10；*P < 0.05，**P < 0.01。

  4 CRP提取物可降低HFD诱导的生命早期AZT暴露小鼠的血清炎症水平

ELISA结果显示，与对照组相比，HFD组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高。值得注意的是，与HFD组相比，AZT进一步增加了TNF-α、IL-6和IL-1β水平，而CRP饮食缓解了AZT处理小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β水平的增加(图5A-C)。这些结果表明，CRP提取物可降低AZT处理的HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠的血清炎症水平。

 图5 组间血清炎症及氧化三甲胺(TMAO)水平。(A)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。(B)白细胞介素-6(IL-6)。(C)白细胞介素-1β(IL-1β)。(D) TMAO。采用方差分析评估差异。数据以平均值±SEM表示，每组n=10；*P < 0.05。

  5 CRP提取物可降低HFD诱导的生命早期AZT暴露小鼠的血清TMAO水平

结果显示，与对照组相比，HFD组血清TMAO水平升高。更重要的是，与HFD组相比，AZT组TMAO水平进一步升高，且与AZT组相比，CRP饮食显著降低了血清TMAO水平(图5D)。这些结果表明，CRP提取物可降低AZT处理的HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠的血清TMAO水平。

  6 CRP提取物抑制HFD诱导的生命早期AZT暴露小鼠的NLRP3/Caspase-1信号通路

Western blotting结果显示，与对照组相比，HFD组肝脏中NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达升高。值得注意的是，与HFD组相比，AZT组肝脏中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表达进一步增加，而与AZT组相比，CRP饮食显著降低了这些肝脏蛋白的表达(图6)。这些结果表明，CRP提取物降低了AZT处理的HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠肝脏NLRP3/caspase-1信号通路相关蛋白的表达。

图6 组间肝脏NLRP3/caspase-1信号通路相关蛋白表达水平及灰度分析。采用方差分析评估差异。数据以平均值±SEM表示；*P < 0.05，**P < 0.01。

  7 CRP提取物可恢复HFD诱导的生命早期AZT暴露小鼠失调的肠道微生物群

Shannon指数显示，AZT组小鼠肠道的微生物群落丰富度较HFD组显著降低，CRP组较AZT组的群落丰富度增加。而HFD组与对照组的群落丰富度无显著差异(图7A)。基于Unifrac的PCoA分析显示，HFD、AZT和CRP组与对照组聚类不同，且在这些组中存在重叠(图7B)。

在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为各组的优势门(图8A)。HFD显著增加了肠道菌群中厚壁菌门的相对丰度，而HFD组与对照组间厚壁菌门的相对丰度无显著差异。值得注意的是，与HFD组相比，AZT组厚壁菌门的相对丰度增加，拟杆菌门的相对丰度降低。与AZT组相比，CRP组的厚壁菌门的相对丰度显著降低，拟杆菌门的相对丰度显著增加(图8B,C)。总体而言，AZT组厚壁菌门/拟杆菌门比值增加，CRP组厚壁菌门/拟杆菌门比值降低(图8D)。

图7 组间的α多样性和β多样性(CRP组n=9，其他组n=10)。(A) α多样性。该值越大，肠道微生物群落丰富度越高。(B) β多样性。群落间距离越大，群落丰富度差异越大。

 图8 组间粪便中门水平微生物的变化。(A)门水平上微生物相对丰度的变化。(B)厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度。(C)拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度。(D)厚壁菌门/拟杆菌门比值。采用方差分析评估差异。数据以平均值±SEM表示，CRP组n=9，其他组n=10；*P < 0.05，**P < 0.01。

在属水平上，与对照组相比，HFD组副拟杆菌属(Parabacteroides)的相对丰度显著降低，萨特菌属(Sutterella)的相对丰度显著增加。与HFD组相比，AZT组Parabacteroides、Adlercreutzia和普雷沃氏菌属(Prevotella)的相对丰度显著降低，Sutterella的相对丰度显著增加。更重要的是，与AZT组相比，CRP组Parabacteroides、Adlercreutzia和Prevotella的相对丰度显著增加，Sutterella的相对丰度降低(图9)。

为了进一步确定各组间粪便微生物群落的差异，我们在热图中以相对丰度的函数表示36个属(图10)。某些细菌的相对丰度，如AZT组中肠球菌属(Enterococcus)和链球菌属(Streptococcus)的相对丰度增加，其在CRP组的相对丰度降低；但没有显著差异。Spearman相关性分析显示，体重和糖脂代谢的改善与Bilophila的相对丰度呈负相关，与双歧杆菌属(Bifidobacterium)、韦荣球菌属(Veillonella)、Prevotella、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)和丁酸弧菌属(Butyricimonas)的相对丰度呈正相关(图11)。综上所述，这些结果表明，CRP提取物可改善AZT处理的HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠的肠道微生物群失调。

图9 组间粪便中属水平微生物的变化。(A)属水平上微生物相对丰度的变化。(B) Parabacteroides的相对丰度。(C) Adlercreutzia的相对丰度。(D) Prevotella的相对丰度。(E) Sutterella的相对丰度。数据以平均值±SEM表示，CRP组n=9，其他组n=10；*P < 0.05，**P < 0.01。

  图10 组间属水平物种热图。 红色表示高值；蓝色表示低值。

  图11 4组小鼠糖脂代谢指标与属水平微生物的Spearman相关性。红色表示高值，蓝色表示低值。数据以平均值±SEM表示，CRP组n = 9，其他组n = 10。* P＜0.05, * * P＜0.01 * * * P ＜0.001。

讨论

AZT是第二代广谱大环内酯类抗生素。AZT主要用于治疗小儿呼吸道感染，它在儿科人群中的使用仅在青霉素之前。尽管青霉素是儿科人群使用的主要抗生素，但研究表明，在相同条件下，大环内酯类抗生素的使用所导致的肠道微生物群失调比青霉素更严重。研究表明，幼年小鼠AZT暴露引起的肠道微生物群失调可促进HFD诱导的成年小鼠糖脂代谢紊乱。因此，本研究首先利用AZT暴露来引起幼年小鼠肠道微生物群失调，然后成年小鼠喂食HFD诱导糖脂代谢紊乱。最后，用CRP提取物治疗小鼠，研究CRP是否调节小鼠失调的肠道菌群。

CRP被广泛应用于治疗疾病的药物和食品制备的原料。因此，长期以来有证据表明它对全体人民的日常健康产生影响。因此，我们选择CRP提取物作为治疗方法，而不是CRP提取物的组成成分，并观察其疗效和可能的作用机制。首先进行UPLC-Q/TOF质谱分析，探讨CRP提取物可能的成分。结果表明，在检测到的7种成分中，柚皮苷、橙皮苷、枸橘甙、川陈皮素和橘皮素均对糖脂代谢紊乱有改善作用，而柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素和橘皮素对肠道微生物有调节作用。值得注意的是，橙皮苷是CRP提取物药物标准中应检测的成分，表明橙皮苷可能在这一过程中发挥关键作用(补充材料：CRP提取物药物标准)。但CRP提取物中各成分的含量及作用尚需进一步研究。综上所述，这些发现表明，CRP提取物可改善儿童期肠道菌群失调，从而改善HFD诱导的成年期糖脂代谢紊乱。

为了进一步了解CRP提取物的作用机制，我们采用16S rRNA测序技术评估各组小鼠肠道菌群的变化。结果显示，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)是肠道中的两种优势菌，许多研究表明，糖脂代谢紊乱时，厚壁菌门的相对丰度增加，拟杆菌门的相对丰度降低。Parabacteroides属于卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)，已被发现在相对丰度较低的肥胖人群中更占优势。短链脂肪酸和胆酸是Parabacteroides的主要代谢产物，研究表明，Parabacteroides在HFD诱导的糖脂代谢紊乱小鼠体内的相对丰度降低。Adlercreutzia是放线菌门的一个属，该属最初在人类粪便中发现，并被发现在糖脂代谢中发挥重要作用。研究表明，糖脂代谢紊乱小鼠中Adlercreutzia含量较低。Prevotella和Paraprevotella能降解食物中的碳水化合物和多糖，并参与体内维生素的合成。有研究表明，Prevotella和Paraprevotella的丰度与血清TG、TC和LDL-C水平呈负相关，与HDL-C水平呈正相关，表明Prevotella和Paraprevotella可能具有抗肥胖作用。Sutterella属于萨特菌科(Sutterellaceae)，已被证明与肝脏脂肪生成有关；研究表明，Sutterella的相对丰度在肥胖个体中增加。Bilophila是一种产生脂多糖的细菌，可加剧HFD-小鼠的炎症并导致代谢紊乱。研究表明，糖脂代谢紊乱的小鼠Bilophila的相对丰度较低。双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种产生短链脂肪酸(SCFAs)的细菌，可以降解多糖和膳食纤维。Bifidobacterium的相对丰度与改善体重和糖脂代谢直接相关。Veillonella与乳酸代谢相关，与糖脂代谢呈正相关。丁酸弧菌(Butyricimonas)是一种可以产生短链脂肪酸来减少炎症的有益细菌。研究表明，Butyricimonas相对丰度的增加与小鼠代谢参数和胰岛素抵抗改善相关。综上所述，这些结果表明，CRP提取物改善了AZT处理的幼年小鼠的肠道微生物群，并改善了喂食HFD成年小鼠的糖脂代谢紊乱。

热图显示，AZT组肠球菌(Enterococcus)和链球菌(Streptococcus)的相对丰度呈上升趋势，其在CRP组呈下降趋势。肠球菌(Enterococcus)是存在于人和动物体内的常见肠道微生物群之一。此前人们认为它对人体无害，但近年来它的致病性得到了证实。研究表明，Enterococcus能够增加肥胖和导致胰岛素抵抗。大多数链球菌(Streptococcus)是条件致病菌，可以导致身体感染，如败血症和心内膜炎。研究表明，肥胖个体中链球菌的相对丰度增加。肠球菌和链球菌可通过微生物酶复合物将胆碱物质代谢为三甲胺(TMA)，最终提高血清TMAO水平。因此，本研究检测了血清中TMAO水平。结果显示，AZT组血清TMAO水平升高，CRP组血清TMAO水平降低。糖脂代谢紊乱常伴有轻度慢性炎症，NLRP3/caspase-1信号通路在糖脂代谢紊乱的炎症发展中发挥重要作用。研究表明，TMAO可能通过增加NLRP3/caspase-1介导的炎症而导致糖脂代谢紊乱。因此，本研究检测炎症水平和NLRP3/caspase-1信号通路相关蛋白。结果显示，血清炎症标志物和NLRP3/caspase-1信号通路相关蛋白在AZT组中升高，在CRP组中下降。

需要注意的是，本研究有几个优点和局限性。本研究的优势在于：1)本研究未发现CRP干预所致的不良反应。2）为了减少对动物的刺激，抗生素被溶解在水中，让小鼠自由饮水，而不是灌胃。3)根据方差分析的自由度估计每组所需样本量为5个，但由于肠道菌群检测的个体差异较大，因此每组样本量增加到每组10个。本研究的局限性如下：1) CRP干预剂量只有1种；因此，无法确定CRP与肠道菌群变化之间的剂量-效应关系。但本研究使用的剂量是基于人和小鼠的体表面积转换，其疗效值得肯定。2)只检测了肠道微生物代谢产物TMAO；其他代谢物在这一过程中的作用尚不能确定。本研究结果表明，肠道微生物群的变化与TMAO密切相关，因此有理由相信TMAO可能在这一过程中发挥关键作用。因此，TMAO的重要作用是毋庸置疑的。3)未对CRP各组分含量进行定量分析，以确定起关键作用的有效成分。一个重要的原因是我们想知道CRP提取物的检测成分是否与药物标准具有可比性。4)在动物模型方面，我们应该设立更多的组，探讨AZT和CRP处理对ND下肠道微生物群的影响。但我们的研究足以证明小鼠生命早期AZT暴露是否会促进成年期HFD诱导的糖脂代谢紊乱，以及CRP提取物对这一过程的干预。综上所述，本研究表明小鼠生命早期AZT暴露可促进成年期HFD诱导的糖脂代谢紊乱，而CRP提取物可通过调节AZT诱导的小鼠肠道微生物失调来改善这种糖脂代谢紊乱。

结论

综上所述，结果表明，生命早期AZT暴露增加了成年小鼠对HFD诱导的糖脂代谢紊乱的易感性，而CRP提取物可通过调节肠道微生物群降低小鼠对糖脂代谢紊乱的易感性。这些发现提供了CRP对健康有益的信息，并验证了CRP作为预防抗生素相关糖脂代谢紊乱的有效干预手段的潜力。