Nature:脂质信号转导增强了肿瘤Treg细胞的功能专一性

1. 免疫代谢在调节细胞状态和命运中的基本作用已开始被阐明，但特定环境决定的代谢作用尚未得到充分诠释，特别是Treg细胞，其如何重新连接代谢程序以增强Treg细胞对肿瘤的功能适应。为了探索Treg细胞在肿瘤中的功能适应的分子机制，使用B16黑色素瘤接种WT小鼠后，对从肿瘤和瘤旁组织中分离出来的Treg细胞与外周淋巴结(PLNs)的作比较，进行了转录组分析。使用固化代谢途径的基因组富集分析(GSEA)，提示：与PLNs相比，肿瘤中的Treg与脂质代谢相关的途径的富集度最高(Fig. 1a)。特别是固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)，作为促进脂类重新合成的转录因子，在GSEA中显示为高度富集的靶基因。遗传通路分析还显示，在瘤内Treg细胞的转录调节因子中，SREBP1（由Srebf1编码）和 SREBP2（由Srebf2编码）为上游顶部富集区。该富集区在小鼠黑色素瘤模型的公共单细胞RNA测序(scRNAseq)数据集中得到了进一步的证实，并在其他肿瘤细胞如乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌中得到相似的结果。由此表明：在肿瘤微环境(TME)中的Treg细胞上调了SREBP基因。

2. 为了确定SREBP信号通路在Treg细胞中的重要功能，使用Cre/loxP重组酶系统，建立了MC38腺癌小鼠及B16黑色素瘤小鼠模型的SCAP基因敲除鼠。SCAP(SREBP裂解激活蛋白)基因作为SREBP激活的必要启动子，被敲除后，明显抑制了小鼠黑色素瘤瘤内Treg细胞中SREBP基因靶点的表达。且Foxp3Cre Scapfl/fl小鼠中，B16黑色素瘤的生长显著减少（Fig. 1c）。为了探索SCAP/SREBP信号通路是否可作为肿瘤治疗的潜在标靶，研究人员亦建立了肿瘤小鼠中Treg细胞Scap基因的急性敲除模型，在成瘤后予以他莫昔芬和抗PD-1免疫治疗，在两种治疗方案下，SCAP敲除小鼠的肿瘤生长都有所减少，且对抗PD-1治疗尤为敏感(Fig. d-f)。以上结果提示：针对Treg细胞中的SCAP/SREBP信号通路的靶向治疗会释放出强大的抗肿瘤作用。

3. 为了确定SCAP缺陷Treg细胞在形成TME中的影响，研究者使用scRNAseq来描述B16肿瘤小鼠的CD45+免疫细胞(Fig. 2a)。与对照组相比，Foxp3CreScapfl/fl小鼠的TME中总/效应/记忆CD8+T细胞和总Foxp3-CD4+T细胞的比例增加(Fig 2)，并通过流式细胞术分析进行验证。 

4. CD8+T细胞与Treg细胞的比例是癌症相关的关键预后因子，在Foxp3CreScapfl/fl肿瘤中其比例也是增加的(Fig. 2c)。然而MC38结肠腺癌在Foxp3CreScapfl/fl小鼠中被排斥（Fig.1b），这样CD8+T细胞的耗竭导致部分肿瘤恢复生长，表明此效应部分依赖于CD8+T细胞的功能。

5. 此外，scRNAseq分析确定了Foxp3CreScapfl/fl小鼠肿瘤中Treg细胞的比例降低(Fig. 2b)。流式细胞术分析还显示，肿瘤中Treg细胞的占比降低，但其在Foxp3CreScapfl/fl小鼠的PLNs的占比没有降低，而瘤内Treg细胞的数量没有减少，可能是因为肿瘤浸润性淋巴细胞总数的增加。与肿瘤相比，在稳态下Treg细胞的积累没有变化。

6. 接着本文确定了SCAP缺乏对Treg细胞增殖状态的影响。与CD8+T细胞增殖中SCAP介导的胆固醇生物合成的要求一致，体外急性抗原刺激后，SCAP缺陷的Treg细胞显示有缺陷增殖，但这种缺陷可被胆固醇补充剂部分逆转。然而，Foxp3CreScapfl/fl小鼠肿瘤中的Treg细胞或PLNs并没有显示出胸苷类似物BrdU的变化，而SCAP缺乏对PLNs的Treg细胞也表现出由淋巴细胞减少诱导出增殖，这种现象同样也能被IL-2/抗IL-2复合物的治疗而引起。此外，与代谢驱动的增殖密切相关的CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)的表达并没有因SCAP缺乏而改变。因此，SCAP功能在稳态和TME下对Treg细胞的增殖很大程度上是可有可无的，这突出了在CD8+T细胞中观察到的环境特异性增殖需求。

7. 检查Treg细胞的凋亡，发现SCAP缺陷的Treg细胞在肿瘤中活性Caspase-3（一种触发细胞凋亡的蛋白质）染色增加，但在PLNs中没有增加。然而，CD36的表达(调节瘤内Treg细胞生存所需的脂质摄取)和中性脂质的摄取不受SCAP缺乏的影响。同时检测了对照和SCAP缺乏的Treg细胞也显示出类似的线粒体轮廓，包括线粒体质量、膜电位和活性氧的产生。因此，SCAP对脂质摄取和线粒体适应性虽非必要，但有助于瘤内Treg细胞的生存。

 

 

8. 文献亦探讨了SCAP可能参与Treg细胞从静止的rTreg(CD44loCD62Lhi)细胞到激活的aTreg(CD44hiCD62Llo)种群的分化，以及Foxp3表达变化，这两者的表达都是炎症形成的条件。在稳态时，即使SCAP缺失，Foxp3的表达和肿瘤中aTreg的累积无论是数量和比例均无明显变化，所以SCAP在aTreg细胞累积和Foxp3表达变化上也非必要。

9. 在肿瘤内有一种特殊的“脆弱Treg细胞”，它表达Foxp3，但却存在分泌IFNγ障碍。研究发现，在稳态时，可分泌IFNγ的Treg细胞并未因为SCAP缺乏而发生改变；但与对照组相比，在SCAP缺失小鼠肿瘤内，能分泌干扰素的IFNγ+Treg表达增加（PLNs内却无此变化），且无论是B16黑色素瘤还是MC38结肠腺癌模型的肿瘤生长速度均受到显著抑制，这与脆弱Treg细胞在肿瘤中重塑TME的作用一致。

10. 对照组和Foxp3CreScapfl/fl小鼠的肿瘤浸润性Treg细胞进行转录组分析，SREBP在肿瘤Treg细胞中激活两种脂代谢通路, 包括脂肪酸合成和甲羟戊酸(mevalonate)代谢途径(Fig. 3a,b)。进一步的研究发现：Treg细胞中的FASN（脂肪酸合酶）缺失抑制了MC38和B16肿瘤的生长(Fig. 3c,d),但受SCAP缺失影响的仅TME。而FASN缺乏的Treg细胞中脂肪酸代谢途径下调。值得注意的是，由激活的TCRs（T细胞抗原受体）所驱动的Treg特异性基因也被下调了。假设FASN信号传递有助于Treg细胞的TCR依赖性激活和/或功能成熟。新分离的FASN缺乏Treg细胞在体外具有正常的抑制功能，由TCR诱导激活后，FASN缺陷激活的Treg细胞功能降低。为了将FASN与脂肪酸合成联系起来，体外添加了FASN的产物——棕榈酸盐，发现可恢复因FASN缺乏导致的Treg细胞激活障碍的作用（Fig. 3e）。此外，尽管有正常TCR诱导的增殖，FASN缺乏仍损害了TCR依赖的Treg细胞激活和成熟的标记上调。综上所述，FASN介导脂肪酸合成通路可促进瘤内Treg细胞的功能成熟，从而促进肿瘤生长。

11. SCAP/SREBP激活下游的其他机制也通过scRNAseq和流式细胞术进行分析，瘤内SCAP缺乏的Treg细胞降低其Pdcd1及PD-1表达显著降低，但在PLNs中没有降低(Fig. 3f)。相比之下，SCAP缺陷的Treg细胞在Treg特征分子CTLA4、ICOS、CD69、CD25、Nrp-1、CD39和CD73有正常表达。稳态下，Foxp3CreScapfl/fl小鼠的脾脏或NLT（非淋巴样组织）上的PD-1表达没有改变。因此，SCAP/SREBP信号是肿瘤中Treg细胞表达PD-1的必要信号，而在PLNs和NLT中则不需要。PD-1已被证明通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的抑制信号，而PI3K的激活与Treg细胞的IFNγ产生的增加有关。抗PD-1治疗后，增加了Treg细胞中的IFNγ表达,且Treg细胞在肿瘤中pAKT和S6蛋白水平升高，但在PLNs中没有(Fig.3g, h)。而SCAP缺乏的Treg细胞在肿瘤中pAKT和S6水平亦升高，进一步支持SCAP和PD-1信号在瘤内Treg细胞PI3K活性中的作用(Fig. 3i, j)。SCAP/SREBP和PD-1抑制了肿瘤内Treg细胞中的IFNγ表达和PI3K信号传导。

12. 为了确定TME和其他背景对Treg细胞的PD-1表达的影响，并检查不同模型中PD-1的调节。与脾脏Treg细胞相比，TME Treg细胞诱导PD-1表达增加；然而，在EAE模型中并没有观察到Treg细胞诱导PD-1的表达增加(Fig. 4a)。在分子水平上SREBP信号是如何调控PD-1的表达，与上述表面蛋白的调节相一致,在肿瘤中，Pdcd1但不是Icos，其mRNA的表达降低，但在PLNs中没有发现差异(Fig. 4b)，提示SREBP信号主要影响瘤内Treg细胞中Pdcd1表达。

13. 为了确定调节PD-1表达的上游信号，对从TME中分离出来的PD-1hi和PD-1loTreg细胞进行了转录组分析。PD-1hi细胞中Treg特异性的TCR依赖的基因及Nur77-GFP的表达升高(Fig.4d)。此外，体外TCR刺激后，PD-1在Treg细胞上的表达上调，同时也上调了SREBP基因靶点的表达，表明PD-1表达依赖TCR诱导。值得注意的是，Treg细胞中的SCAP缺失损害了TCR诱导的表面PD-1的表达(Fig. 4e)。因此，SCAP/SREBP信号传递将TCR刺激与Treg细胞上的PD-1表达联系起来。

14. SREBPs调节脂肪酸合成和甲戊酸代谢酶的表达。脂肪酸的合成对于PD-1的表达是不可或缺的，因为PD-1的水平在瘤内FASN缺乏的Treg细胞上不受干扰，甲戊酸代谢的参与，有助于合成胆固醇和异戊二烯类，且甲戊酸代谢有助于胆固醇和异戊二烯类药物的合成。通过代谢组学追踪示，SCAP缺乏的Treg细胞中醋酸衍生碳与胆固醇的结合有所减少(Fig. 4f)。针对甲戊酸代谢中的限速酶HMGCR的辛伐他汀，可以抑制TCR刺激的Treg细胞上PD-1的表达(Fig. 4g)。此外，HMGCR缺陷的Treg细胞在TCR刺激时显示PD-1表达有缺陷。然而，补充SCAP缺陷的Treg细胞的胆固醇，可部分纠正增殖缺陷。CTLA4的上调，不影响PD-1的表达。这些结果揭示了与胆固醇无关的甲戊酸盐代谢对Treg细胞PD-1调节的重要性。

15. 除胆固醇外，甲戊酸盐途径还分别生成类异戊二烯法尼基焦磷酸酯(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)， 这些脂质分子通过法尼基转移酶（Fntb编码的催化基因）和香叶酰香叶酰转移酶I型（Pggt1b编码的催化亚基）的酶活性调节法尼基化和香叶基香叶化的翻译后蛋白修饰。HMGCR下游的代谢物在辛伐他汀治疗的Treg细胞上的PD-1表达。(Fig. 4h)。值得注意的是，GGPP治疗也恢复了这些细胞上PD-1的表达，而FPP只显示出轻微的补救效果(Fig. 4h)。此外，甲戊酸盐或GGPP治疗也在很大程度上挽救了辛伐他汀治疗的Treg细胞中Pdcd1mRNA的表达。这些结果表明GGPP依赖蛋白香叶基香叶化在促进Treg细胞PD-1表达中的作用。 

综上所述，SCAP的缺失会导致肿瘤组织而不是外周淋巴结中Treg细胞上PD-1表达减少，甲羟戊酸代谢介导的蛋白四异戊二烯化可增强Treg细胞中PD-1的表达。如此，SCAP/SREBP介导的脂质代谢通路对于Treg细胞特异性的在肿瘤微环境中发挥重要作用，为肿瘤免疫治疗提供了新的细胞和分子靶点，也再次强调了脂肪代谢在免疫系统中的地位。

编译：凌佳倩

审校：张军，缪长虹