科研 | BMC Biology（IF：7.431）：基于竞争的筛选有助于确保防御微生物组的进化稳定性

编译：微科盟鼻涕，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

RNA-SIP跟踪重同位素从宿主到代谢来源于宿主资源的微生物群落RNA的流动。样品中的标记RNA和未标记RNA可通过超离心法分离；这些片段可以作为16S rRNA基因扩增子测序的模板，这样就可以识别出使用（和不使用）宿主资源的细菌类群。在该实验中，选择RNA而不是DNA，以增加在短时间内标记的机会；RNA标记需要主动转录，而DNA标记需要DNA复制。尤其是放线菌，只有在它们产孢时才会大量上调DNA复制。更短的时间也是可取的，因为它减少了细菌物种之间的交叉喂养，尽管我们注意到，通过交叉喂养获得的任何资源在筛选模型中都被视为公共资源，因为它们最终也有助于细菌的生长和代谢。本文将22只成年工蚁分为3个重复组，分别喂食20%（w/v）的12C或13C葡萄糖溶液10天，然后解剖前胸膜板提取总RNA（附加文件1：图S1）。对照喂食实验表明，在喂食过程中，荧光标记的葡萄糖-水饮食没有转移到蚂蚁的胸膜区域表面，并且只观察到蚂蚁使用下颌骨进食，因此它们的前胸膜从未进入直接接触流质食物（附加文件1：图S2）。

cDNA合成和16S rRNA基因扩增测序结果显示，12C和13C喂养的蚂蚁胸膜前板样品中，丝状放线菌（filamentous actinomycetes）分别占76.6%和78.0%（图1）。假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的相对丰度最高，在12C和13C样品中分别为35.8%和38.1%，链霉菌属（Streptomyces）分别为19.7%和20.5%，沃尔巴克氏菌（Wolbachia）分别占22.8%和19.6%。沃尔巴克氏菌（Wolbachia）已知与A. echinatior蚁的胸肌有关，在那里它们可能有一种未指明的互惠功能。我们认为这些读长来自于解剖前胸膜板上残留的微量蚂蚁组织，无需进一步考虑。未分级 RNA 样品中超过 95% 的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）16S rRNA 基因读长在序列上与单个P. octospinosus共生菌株相同。链霉菌（Streptomyces）和其他放线菌（actinomycete）的存在与之前的研究一致，即环境获得的、产生抗生素的放线菌可以在表皮微生物群中建立，尽管这些大型工作菌已经首先接种了垂直传播的共生体假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）。

采用三氟乙酸铯密度梯度超离心分离13C喂养样本中标记较重的RNA和未标记较轻的12C RNA（附加文件1：图S1）。对照组12C饲料处理的RNA样本也进行了密度梯度超离心。通过浮力密度超离心法对所得梯度进行分馏，并将每个分馏的cDNA用于定量RT-PCR反应（附加文件1：图S3&S4）。这表明，在13C饮食处理下，16S rRNA基因转录本已向更高的浮力密度转移（附加文件1：图S3）。在12C处理下，在平均浮力密度为1.789 g ml-1（± 0.003 SD）时检测到转录本的峰值，但在13C饮食处理下，这一峰值已转移到一个显著更高的浮力密度（1.797 g ml-1 ± 0.001，在双样本t检验中P = 0.016）（附加文件1：图S4）。由于标记的宿主资源的代谢，这与较重的13C同位素被纳入角质层细菌的RNA是一致的（附加文件1：图S4）。

我们选择跨越转录数峰值的部分进行16S rRNA基因扩增子测序（附加文件1：图S4）。通过测序鉴定的类群的相对丰度进一步归一化，使用qPCR实验中每个片段中检测到的16S rRNA基因转录本的百分比；这是为了解释在每个片段中检测到的16S rRNA基因转录本的绝对丰度的差异，也为了便于比较处理内部和跨处理的重复，这在总RNA提取量上是不同的。测序证实，在13C处理下，放线菌属的转录本已转移到更高的浮力密度（图2A-C）。例如，垂直传播的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的丰度跟踪了使用qPCR鉴定的16S rRNA基因转录本总数的变化（图2A，附加文件1：图S4）。具体来说，在13C处理的峰值部分中，假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）序列的平均相对丰度为36.30%（± 7.22）（平均浮力密度1.797 g ml-1 ± 0.001，图2A）-这些片段平均包含样本中16S rRNA基因转录本总数的66.45%（± 12.34）（附加文件1：图S4），平均正常化丰度为23.57 ± 1.67（图2A）。尽管在12C处理下，在等效浮力密度的馏分中也检测到了假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）序列（图2A），但这些馏分包含的16S rRNA基因转录本总数不到这些样本的2%（附加文件1：图S4）；因此，平均归一化丰度为0.78 ± 1.29（图2A）。在12C处理下，假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）转录本丰度在明显较低的浮密度（1.789 g ml-1 ± 0.003, P = 0.016）时达到峰值。除了假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）外，水平获取的类群，包括链霉菌（Streptomyces）和微杆菌（Microbacterium），在13C处理下也表现出类似的浮力密度变化，并在13C样品的峰值组分中丰富（图2B，C）。例如，链霉菌（Streptomyces）在13C样品的峰值部分的平均归一化丰度为12.790 ± 2.758。这表明来源于蚂蚁的资源不仅可用于假诺卡氏菌属（Pseudonocardia），否则它们将不但主导13C重馏分，并且可用于表皮上的所有细菌并被它们吸收。

在13C重处理下，沃尔巴克氏菌（Wolbachia）的频率也向重馏分转移（图2D）。由于沃尔巴克氏菌（Wolbachia）在这种特殊的共生关系中是细胞外肌肉组织共生体，这一发现支持了以下解释：资源是由蚂蚁宿主提供给表皮细菌的，而不是直接从葡萄糖水中获取的。这种解释也得到了同位素比质谱分析（IRMS）的支持，该分析显示，经过表面清洗的蚂蚁将大量来自葡萄糖的13C吸收到它们的体内（附加文件1：图S5），并且通过直接荧光显微镜显示葡萄糖水没有转移到胸膜前板（附加文件1：图S2）。需要注意的是在12C和13C处理中排除沃尔巴克氏菌（Wolbachia）后，当仅考虑表皮微生物组时，所有其他类群的丰度分别增加了约20%和约50%（图2）。

图1. 在提供20%（w/v）12C或13C标记葡萄糖溶液的蚂蚁胸膜前板的未分离RNA样本中，不同分类水平的细菌频率。（A）门分解，表明> 75%是放线菌；（B）属水平分辨率显示，表皮微生物群落以本底的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）共生菌为主，其次是水平获得的链霉菌（Streptomyces）和一系列其他低流行率放线菌（Actinobacteria）。

图2. 从喂食13C（黑色）或12C（灰色）葡萄糖的蚂蚁的RNA样本中，假诺卡氏菌属（A）、链霉菌属（B）、微杆菌属（C）和沃尔巴克氏菌属（D）的正常化丰度。每个处理有三个重复的样本。属的相对丰度通过乘以样品中每个部分中16S rRNA基因转录本的百分比来归一化（见附加文件1：图S4）。

此前，我们对5株假诺卡氏菌属（Pseudonocardia octospinosus）和5株P. echinatior进行了高质量的基因组测序，并在它们的每个基因组中鉴定了几个与抗菌活性相关的BGCs（生物合成基因簇）。为了确定这些BGCs在体内是否在蚂蚁表皮上表达，我们从捕获蚁群Ae088（宿主为垂直传播的P. echinatior菌株）和Ae1083（宿主为P. octospinosus菌株）的前胸膜板上提取了总RNA并进行了测序。对每个蚁群进行单个RNA提取，每个样本由80只蚂蚁的胸膜前板组成。对RNA样本进行测序，并对测序结果进行筛选，并将其映射到相应的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）参考基因组中（附加文件1：表S2）。两种假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）在体内表现出非常相似的基因表达模式，其中涉及次级代谢产物产生的基因，包括抗生素（由KEGG分类），这两种假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）在A. echinatior蚁的角质层上表达水平相似（附加文件1：图S6）。

P. octospinosus和P. echinatior菌株共享的BGCs（附加文件1：图S3）在前胸膜板上的原位表达模式非常相似（图3A）。对于这两种假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）植物，表达最多的BGCs编码合成化合物外叶素和一种推测的类胡萝卜素萜类色素的蛋白（集群D和F，图3A）。这些化合物已知能提供对非生物压力的保护，如干燥和高浓度的自由基，这些通常与生物膜有关。同样在胸膜前板上表达的是一个共享的BGC，编码一种推定的细菌素（集群E，图3A），属于由许多种细菌产生的核糖体合成翻译后修饰肽（RiPP）抗生素家族；这些物质可以防止其他微生物形成生物膜。相比之下，编码类制霉菌素抗真菌化合物的共享型1型PKS基因簇在P. echinatior菌株中表达非常低，而在P. octospinosus菌株中完全不表达（集群C，图3A）。这表明激活BGC可能需要额外的信号，如直接暴露于E. weberi可能需要激活BGC，因为这两种假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）菌株在体外与E. weberi对抗时都产生抑菌抗真菌（附加文件1：图S7）。从Acromyrmex蚂蚁中分离出的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）菌株在体外也被证明能产生类制霉菌素的化合物。P. echinatior（集群P，图3C）或P. octospinosus（集群J，图3B）所特有的高表达BGCs均被预测编码细菌素。

综上所述，RNA-SIP和RNA测序实验的结果与之前的实证研究和筛选假设一致：蚂蚁宿主通过腺分泌物为其表皮微生物群提供公共资源，而外共生菌可能会与之竞争。这通常是在本地假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）已经建立并获得优势之后，为任何额外的菌株入侵创造了一个苛刻的表皮环境。

图3. （A）在两个假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）物种之间共享的生物合成基因簇，（B）P. octospinosus特有的生物合成基因簇（群落Ae1083），（C）P. echinatior特有的生物合成基因簇（群落Ae088）的表达【每千碱基转录本读长的每百万映射读长（RPKM）】。生物合成基因簇编码涉及附加文件1：表S3。每个蚁群的结果来自80只蚂蚁。

图4. 增长速度的实验，30℃下5天后测量菌落大小。箱线图显示中位数±四分位数。白色部分显示对照培养基上的生长速率，彩色部分显示添加Pseudonocardia的培养基上的生长速率。红框代表非抗生素产生菌株，蓝框代表抗生素产生链霉菌菌株。线性混合效应模型包括17株Pseudonocardia和20种接种的细菌作为随机截取，用于测试生长培养基（对照组vs.添加Ps1 vs.添加Ps2）和抗生素生产（非生产者vs.生产者）的相互作用和主要效应：lme4::lmer【生长评分~生长培养基×抗生素生产+ (1|Ps菌株/Plate) + (1|In菌株)】。一种非产菌菌株（表皮葡萄球菌）的生长速度比其他所有菌株（开放三角点）都快，这表明需要控制相关残留。

图5. 生产菌株和非生产菌株的抗生素耐药性概况（A LEC和B MIC），基于每种菌株在八种测试抗生素上的平均生长得分（详细见附加文件1：表S4）。箱形图表示中位数（凹槽）± 四分之一。B中的‘Rabbit ears’表示中位数也是最高值。

图6. 两两竞争实验，得分生产者获胜的频率。（A）接种后5天琼脂平板的代表性图像显示了三种竞争结果的例子：赢（Ps2基质上的生产者S2 vs.非生产者St3）、输（对照基质上的生产者S8 vs.非生产者St3）和平局（对照基质上的生产者S2 vs.非生产者St3）（附加文件1：表S1）。（B）两种链霉菌生产菌株的竞争结果的柱状图（S8和S2；附加文件1：表S1）。每一种链霉菌菌株分别与10种不同的非抗生素产生菌株进行竞争。链霉菌更有可能赢得添加Pseudonocardia的介质。一个一般的线性混合效应模型，10个非抗生素产生菌株作为随机截取，用来测试培养基（对照组和添加Ps）对竞争结果（赢和输）的影响。为了分析，略去了绘图。S8在添加Ps1的培养基上：nPs1-infused= 34，nControl= 95，χ2 = 103.6，df = 1，P < 0.0001；S2在添加Ps2的培养基上：一般线性混合效应模型，nPs2-infused = 50，nControl = 44，χ2 = 87.9，df = 1，P < 0.0001。Ime4::glmer【结果~培养基 +（1 |非产生株），科=二项式】。

我们以切叶蚁Acromyrmex echinatior表皮微生物组为实验模型，对筛选理论进行了检验。通过RNA-SIP来验证动物宿主直接喂养它的微生物群（图2）。进一步证明了资源是公共的，这意味着资源不仅用于垂直传播的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的生长，也用于蚂蚁角质层上环境获得的多种细菌的生长（图2）。然后，在两个独立的蚁群中，我们证明了P. octospinosus和P. echinatior都在蚂蚁表皮上表达抗菌生物合成基因簇（BGCs）（图3）。接下来，我们发现这两种放线菌在体外对环境分离物具有广谱抗菌活性，重要的是，它们对链霉菌的作用比非生产菌的弱（图4），这与这些链霉菌对一系列抗生素具有耐药性相一致（图5），这是该属的典型特征。最后，我们使用体外竞争实验证明了只有当竞争物种在注入假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）代谢产物的培养基上生长时，链霉菌可以竞争性地排除生长速度更快但不制造抗生素的细菌（图6）。

虽然RNA-SIP实验的饲喂处理时间很短（10天），但有可能一些细菌共生体通过使用直接取食蚂蚁来源的其他微生物产生的标记代谢物，间接获得资源。然而，交叉喂养仍然与食物资源是公共的相一致，也与基于竞争的筛选相一致。由于包括水平获取的放线菌在内的多种细菌物种，仍然在占用宿主提供的资源生长，从而加剧了物种之间对宿主空间的竞争，尽管它们的作用是间接的。

综上所述，这些结果与以下假设一致：基于竞争的筛选是维持切叶蚁养殖共生关系及其防御菌群之间的合作互惠关系完整性的一种可行机制，预测的条件是垂直传播的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）共生生物总是第一个建立和创造一个苛刻的环境。由于幼小的大型工蜂在出蛹的24小时内由它们的巢友接种，这种优先建立的情况总是如此。正如Scheuring和Yu所预测的，以及Andersen等人的经验表明，假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）从未被排除在微生物组之外。事实上，早期定殖和营养物质的最初优势使得假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）在其他微生物定殖于蚂蚁表皮之前形成密集的生长。这里报告的新结果说明了表皮切叶蚁微生物组的可处理性，这是易于实验的，对蚂蚁宿主的适应性效益有明确的定义和明确的可测试性：防御特殊的Escovopsis病原体和群体崩溃。我们目前的结果与我们之前的假设一致，即假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的垂直传播导致链霉菌株（Streptomyces strains）成为二次获得的优势竞争者。

关于筛选的另一种假设是，蚂蚁通过加密解密机制选择性地获得额外的产生抗生素的细菌，就像豆科植物通过特定物种的结瘤因子信号分子识别根瘤菌（Rhizobium）共生体一样。然而，加密解密信号需要所有候选共生体和宿主谱系之间紧密的共同进化，这可能对与Acromyrmex-相关的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）物种是正确的，但对于能够在蚂蚁角质层上建立的放线菌门的其他属是极不可能的（图1）。相比之下，豆科植物只与一个属的根瘤菌共生。

有盖培养皿竞争实验有一个重要的优势，那就是允许明确的赢、输的得分，并利用带有或不带有假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的培养基。未来的工作应该专注于增加现实主义，因为在角质层上，随着定殖顺序、表皮微环境和资源供应速率的变化，竞争发生在多种物种之间。然而，尽管在新封闭的工蚁上可以防止假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的建立，技术上的挑战将是在面对神秘物种偏见的情况下，从测序数据集对相对物种丰度进行评分。一种互补的方法是比较野生型和敲除型假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）菌株在体外和体内的竞争，这些菌株无法产生RNA-seq实验中观察到的抗菌化合物。然而，这样的实验需要广泛的基因改造，到目前为止，这假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）中是非常具有挑战性的。

虽然还没有通过添加或去除实验证明竞争，但我们通过RNA-SIP实验证明了明显的资源利用重叠（图1），通过培养皿实验证明了竞争排斥的能力（图6）。结合链霉菌菌株的指数增长能力和抗生素生产能力，我们对角质层微生物群的争夺和干扰竞争有着强烈的期望。

宿主资源的性质和来源仍然难以捉摸。以前的研究已经观察到假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）长在蚂蚁表皮上的特化腔内或以上，称为中央凹，其下方的结构似乎是外分泌腺。然而，还没有实验证实这些腺体是表皮微生物群的资源来源。另一项研究表明后胸膜腺分泌物(唯一可以合理分布在整个表皮的外分泌物)对幼蚁假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）早期指数生长阶段没有影响。这些腺体的关闭被证明会影响年老蚂蚁假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）的生长，但目前还不清楚在这种情况下，人工操作是否损害了蚂蚁健康的其他方面。

在未来的实验中，有几种新兴的技术可用于定位和识别来源于宿主的基质。例如，高分辨率二次离子质谱成像（NanoSIMS）结合荧光原位杂交（FISH）可以直接可视化不同细菌类群对稳定同位素的同化。该技术已被用于视觉追踪小鼠肠道黏膜分泌的标记化合物的细菌代谢。类似地，拉曼微光谱技术可以创建一个分子或系统的化学指纹，并可以通过发生的光谱转移来识别含有重同位素的化合物。如基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）成像质谱也可以应用于类似的方式，虽然开展极具挑战性，但已被用于图像分布的一种抗真菌化合物的表面A. echinatior蚂蚁。

我们的结果表明，基于竞争的筛选是获得多样化的、产生抗生素的微生物组的一种可行的机制。随之而来的自然问题是，这种机制是否代表了抗氧化酶的适应性，从而提高了对病原体的防御能力。我们知道从Acromyrmex蚂蚁中分离出来的链霉菌可以在体外产生抑制Escovopsis生长的抗真菌药物，但直接的测试将需要实验移除和添加链霉菌（和/或抗生素基因敲除），到目前为止，这是一项重大的技术挑战。然而，如上所述，链霉菌的共生体很少在趋向真菌群落的幼小工蚁身上发现。因此，我们实验中所显示的筛选效果可能是假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）与Acromyrmex相互作用的附带现象。在这种情况下，切叶蚁系统可以被认为是筛选现象的一个易于处理的模型，这种筛选现象可能在其他地方具有适应性意义。另外，额外放线菌物种的适应性好处可能是，它们提高了对觅食工蚁的保护，使其免受菌落之外的细菌和真菌感染，从而也间接地保护了与真菌群落更广泛互动的工蚁。鉴于已知细菌竞争会刺激体外抗菌物质的输出，在单个蚂蚁上有多个菌株可能会通过刺激多种不同抗菌化合物的生产而有益。事实上，Schoenian等人已经直接观察了链霉菌在成熟的Acromyrmex蚁角质层上产生抗菌缬氨霉素的过程。我们还假设，与抗生素生产竞争对手的持续竞争可能会选择假诺卡氏菌属（Pseudonocardia），因为它被attine蚂蚁驯化后，会失去昂贵的抗菌生产基因。

我们的研究结果具有广泛的意义，因为基于竞争的筛选为微生物群落成为进化稳定的生态系统提供了一个机制解释。寄主链通过煽动和偏见竞争，通过公共资源和垂直传播的生产抗生素的共生菌的组合，有利于生产抗生素的细菌的建立。这种观点与宿主相关微生物组可以同时具有与宿主环境共同适应的核心成员和不适应但仍然互惠互利的成员的想法是一致的。对其他共生的研究似乎支持这种双重进化和生态观点，包括与多细胞伙伴的一系列互惠共生以及更具体的微生物组。例如，放线菌双歧杆菌亚种（Bifidobacterium longum subsp.）主导着人类新生儿的肠道。在这种情况下，双歧杆菌是早期的定殖者，因为它是从母亲垂直传播到孩子，双歧杆菌消耗人类母乳中提供的一系列寡糖，以建立足够大的种群，它可以竞争地排除病原体定殖者。我们假设至少在断奶之前，双歧杆菌（Bifidobacterium）可以像假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）一样，选择性地支持肠道中其他双歧杆菌物种的建立。相似之处也可以在Lasius fuliginosus物种的蚂蚁上看到，这种蚂蚁通过一个非常可预测的真菌群落的生长来稳定它的纸箱结构。实验表明，来源于蚂蚁身体部位的抗菌物质可以被这些真菌所容忍，并支持它们的生长，使它们在与其他可疑物种的巢穴结构的共生关系的竞争中胜出。在建立植物根系微生物群的过程中也可能发生类似的过程，并可能在提高作物产量中被操纵。

未来对Acromyrmex模型系统的研究应包括鉴定假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）共生菌株在体外和体内产生的抗菌分子，并将这些化合物与在蚂蚁上表达的BGCs进行匹配。由于蚂蚁衍生的假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）在琼脂平板上生长不良，很少在液体培养中生长，这将是一个挑战。此外，对蚂蚁本身进行质谱成像还不能实现。