科研 | mSphere：宏基因组学揭示了表皮葡萄球菌菌株在早产儿皮肤上的拮抗定植动态

编译：微科盟如风，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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对于所有物种来说，叠氮溴化丙锭（PMA）处理可能无法同样有效地去除非活菌的DNA。因此，我们试图验证PMA处理可以在实验室条件下从相对高浓度的无法存活的表皮葡萄球菌S. epidermidis中清除DNA。我们将肉汤培养的5×108 个CFU/ml活金黄色葡萄球菌S. aureus与等量热杀灭的表皮葡萄球菌S. epidermidis或250ng纯化的表皮葡萄球菌S. epidermidis基因组DNA结合起来。培养物用PMA处理，对照培养物不作处理。我们用MetaPhlAn2分析这些样品的序列，以确定金黄色葡萄球菌S. aureus和表皮葡萄球菌S. epidermidis的相对丰度。与未处理的对照组相比，PMA处理可去除99.7%的热杀灭的表皮葡萄球菌S. epidermidis DNA和98.6%的纯化的基因组DNA（图1A）。

图1 PMA处理对非活菌表皮葡萄球菌S. epidermidis DNA去除的效果。（A）活的金黄色葡萄球菌（橙色）在处理前与热杀灭的表皮葡萄球菌细胞（蓝色）或纯化的表皮葡萄球菌gDNA（蓝色）结合在一起，分4个重复。（B） 在TSB中通过光密度（实线）和加倍时间（虚线）测定表皮葡萄球菌S. epidermidis的生长。（C） 在B组描述的生长过程中，通过GRiD（实线）或SMEG（虚线）估计表皮葡萄球菌S. epidermidis的复制率。样品要么经过PMA处理（红色圆圈），要么未经处理（蓝绿色方块）。采用t检验比较每小时的平均复制率（**，P < 0.01;***，P < 0.001）。

我们还研究了PMA处理是否影响测序数据的复制率估计。通过光密度监测，我们对肉汤培养物生长的9小时内每小时对表皮葡萄球菌S. epidermidis取样一次（图1B）。培养物用PMA处理，对照培养物不作处理。我们分别用GRiD和SMEG分析这些样品的序列，以估计种水平和菌株水平的复制率。这些工具利用了生长速度与染色体起点和末端序列覆盖率之间的关系；快速生长的细胞比缓慢生长的细胞具有更高的起点/终点覆盖率。在第7至9小时，未处理的表皮葡萄球菌S. epidermidis样本的复制率估计值明显高于PMA处理的样本（t检验如下：GRiD，P＜0.0006；SMEG，P＜0.006）（图1C）。因此，未经处理的表皮葡萄球菌的复制率估计值与加倍次数不相关（二阶多项式回归的拟合：GRiD，R2=0.09，P=0.52；SMEG，R2=0.428，P=0.22），而PMA处理过的样品的复制率估计值确实与加倍次数相关（二阶多项式回归拟合：GRiD，R2 = 0.959，P = 0.0037；SMEG，R2 = 0.845，P = 0.0048，详见补充材料图S1）。

经母亲同意，4名出生体重极低（平均600克）、胎龄极小（平均25.1周）的早产儿在出生后第一周登记，并对其微生物组进行纵向取样。在这项研究中，这些婴儿在密西西比大学医学中心的四级新生儿重症监护室（NICU）接受医疗护理。这些婴儿的临床特征列于补充材料表S1。从出生1周到2月龄间，每隔一周进行一次微生物组采样。对6个身体部位进行采样，包括腋窝、腹股沟皱褶、鼻腔、脐周和上胸部的拭子，并在当天的尿布中收集粪便样本。根据PMA处理方案立即对标本进行处理，以富集有活力的微生物组，然后进行DNA提取和浓缩，以及宏基因组鸟枪测序。

我们收集了所有80份皮肤拭子（4个婴儿，4个时间点，5个皮肤部位）以及12个可用的粪便样本，总共92个微生物组样本。其中，32个样本被排除，因为它们要么被污染（n = 1），要么库的浓度<0.09 ng/μl（n = 27），或者被测序但没有产生微生物读数（n = 4）。共60个样本具有微生物读数，包括皮肤拭子（n = 48）和粪便样本（n = 12），并被进一步分析（表1）。平均而言，从皮肤拭子中收集了2110万个读数，其中590万或38.2%是微生物。相比之下，从粪便样本中平均收集了2280万个读数，其中2260万个或99.2%是微生物。在皮肤部位中，鼻腔的平均DNA浓度最高，而且最常给出微生物序列（14/16个拭子为阳性）。腹股沟褶皱和腋窝的平均DNA浓度最低，但也经常给出微生物序列（分别为12/16和9/16的拭子为阳性）（表1）。平均而言，在皮肤部位中，腹股沟折痕和腋窝有最高数量和百分比的微生物读数。相比之下，脐周区域提供的微生物序列最少（5/16个拭子为阳性），而且微生物的平均读数最低（0.99M）（表1）。

表1 不同身体部位的微生物组取样特征。

a. 用乙酸钠-乙醇加糖原浓缩后进行测定，检测限为0.025 ng/μl; b. 运行Illumina NextSeq生成的读取次数; c. 使用KneadData过滤后的读数。

根据MetaPhlAn2分析，在60份微生物组样品中共检测到87种细菌和真菌。有57个物种出现在1个以上的样本中。6个物种（痤疮杆菌Cutibacterium acnes、头状葡萄球菌Staphylococcus capitis、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis、溶血性葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus、口腔链球菌Streptococcus oralis、奇异变形杆菌Proteus mirabilis）出现在所有5个皮肤部位（图2；完整相对丰度列在表S2中）。在很大程度上，表皮葡萄球菌S. epidermidis和头状葡萄球菌S. capitis在皮肤拭子中出现最多（分别为47/48和37/48），平均相对丰度最高（分别为30.7%和31.6%）。此外，在最多的粪便样本（8/12）中检测到表皮葡萄球菌S. epidermidis，但其平均相对丰度（4.5%）低于粪肠球菌Enterococcus faecalis（7/12样本；平均相对丰度13%）和肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae（6/12样本；平均相对丰度7.9%）。

图2 存在于早产儿皮肤所有部位的6个物种的平均相对丰度。<1%的相对丰度可能不可见，但在补充材料的表S2中给出。未出现在所有皮肤部位的物种被列入“其他”类别。

我们在五个皮肤部位中分别没有发现α或β多样性的显著差异；这一发现证明了在随后的分析中汇集皮肤部位的合理性。通过皮肤和粪便之间的Jaccard指数测量的β多样性有显著差异（置换多变量方差分析 [PERMANOVA]， P < 0.001）。此外，随着时间的推移，皮肤上Simpson指数测量的α多样性存在显著差异（方差分析[ANOVA]， P = 0.027）。Simpson指数在第一个和最后一个时间点之间平均增加了2.5倍（线性趋势检验，P = 0.0052），这跨越了所有4个婴儿的抗生素使用期（图3）。随着时间的推移，皮肤上的β多样性也有明显的差异，Jaccard指数显示了不同的物种组成（PERMANOVA，P < 0.027）。例如，在最后两个时间点，肺炎克雷伯菌K. pneumoniae出现的频率更高。

图3 早产婴儿皮肤上的微生物组多样性随时间变化。（上部）显示了皮肤拭子中物种的平均Simpson指数随着时间的推移以及每个婴儿的线图。每个婴儿用不同的颜色和符号表示，每个点代表该周的Simpson指数的平均值。误差棒代表标准偏差。箱线图代表所有婴儿的Simpson指数。（底部）显示在本研究过程中给予婴儿抗生素治疗的持续时间。每个婴儿都用与顶部面板相同的颜色表示。AMP，氨苄青霉素；GEN，庆大霉素；AMK，阿米卡星；VAN，万古霉素；CAZ，头孢他啶；ACV，阿昔洛韦；AMB，两性霉素B；PEN，青霉素。

宏基因组组装是作为表皮葡萄球菌S. epidermidis菌株分型的初步方法。然而，只有9个样本产生了表皮葡萄球菌S. epidermidis的基因组，其中只有4个质量合格（完成度>70%，污染度<5%）（见补充材料中的表S3）。在这4个基因组中，鉴定出了两个菌株。一株是多位点序列2型（ST2），附属基因调节因子（agr） I型，细胞间粘附（ica）生物膜相关基因阳性，而另一株是ST59, agr I型，ica基因阴性。ST2和ST59菌株在遗传上是不同的，在核心基因组的4/7个多焦点序列分型位点和>7,000个单核苷酸多态性（SNPs）上有差异，它们属于不同的遗传簇。有趣的是，由于未检测到过早终止密码子，这两个菌株的agr基因的氨基酸序列完全相同，而且可能是功能性的。抗生素抗性基因的含量是可变的，在两个菌株中都发现了dfrC、fosB和norA基因，在一个ST2菌株的基因组中发现了mecA和mupA（表S3）。

此外，还采用了MIDAS、StrainEst和SMEG三种更灵敏的分析方法对表皮葡萄球菌S. epidermidis进行了鉴定。MIDAS能够识别样品中的主要菌株。故采用MIDAS对24个由MetaPhlAn2估算的>3.5×表皮葡萄球菌S. epidermidis基因组覆盖率的样本进行检测，根据3,051个双等位基因SNPs的等位基因频率，鉴定出ST2和ST59为优势菌株，同时鉴定出1个次要菌株（图4）。StrainEst能够区分混合菌株并估计其相对丰度。StrainEst被应用于33个样本，其覆盖率大于MetaPhlAn2所估计的1×表皮葡萄球菌S. epidermidis。StrainEst确定ST2和ST59为主要菌株，ST5和ST218为次要菌株（图4）。SMEG也能区分混合菌株，并能估计其相对覆盖率和复制率。SMEG应用于与StrainEst相同的33个样本，并确定了两个主要的系统发育集群和一个次要集群；主要集群包含ST2和ST59，次要集群包含ST5（图4）。这三种菌株定型方法在识别优势菌株方面的一致性几乎是完美的，只有一个上胸部皮肤拭子例外，StrainEst和SMEG都识别出ST2的比例略高于ST59，但MIDAS将优势菌株识别为ST59（图4的样本01W1UC）。

物种之间的生态相互作用可以根据相对丰度数据的相关性来推断。为了避免虚假的相关性，我们使用了成分数据的稀疏相关（SparCC）方法来解决使用相对丰度数据进行这种分析的统计问题，我们将重点放在皮肤样本上，以解决某些物种对某些身体部位的偏好。我们将表皮葡萄球菌S. epidermidis的相对丰度分解为由StrainEst估计的特定菌种的相对丰度，然后与其他物种进行比较。ST2和ST59之间出现了统计学意义上的负相关（r = -0.437；P = 0.035）。此外，ST2和痤疮丙酸杆菌C. acnes（r = 0.447；P = 0.07）以及ST59和口腔链球菌S. oralis（r = 0.341； P = 0.06）之间出现了正相关的趋势。ST2和ST59在皮肤拭子中的原位复制率也是相互负相关的，尽管这没有统计学意义（7个样本的两种菌株的复制率，r = -0.490，P = 0.26；扩展分析到32个样本，其中对没有检测到生长的菌株的值设置为1，r = -0.265，P = 0.19）。

我们利用纵向研究设计，进一步研究早产儿皮肤上两种主要的表皮葡萄球菌菌株的皮肤定植动态。首先，我们研究了皮肤定植的时间。为了确定早期定植，我们认为该菌株的相对丰度必须大于50%，并且在给定婴儿和皮肤部位的最早样本中比其他菌株丰度高10%以上。在这项分析中，与ST59相比，ST2在早期定植的皮肤样本中的比例明显更高（比例检验，P < 0.01）（图5A）。接下来，研究人员检查了菌株随时间的变化情况。对于相邻的时间点（与缺失的中间样本连接的时间点），我们可以注意到一个菌株的相对丰度是增加还是减少。在这个分析中，ST59在73%的时间间隔中增加了相对丰度，而ST2在27%的时间间隔中增加了相对丰度（图5B），尽管这并不具有统计学意义。

为了进一步研究ST2和ST59之间的拮抗作用，我们检测了这些菌株背景的参考菌株在纯培养和混合培养中在聚苯乙烯板上产生生物膜的能力。由于从婴儿身上没有培养的分离株，我们研究了来自美国不同州的两个ST2分离株和一个ST59分离株。ST2分离株在隔离培养时都比ST59分离株产生更多的生物膜（ST2-NY与ST59的t检验，P = 0.022；ST2-MS与ST59的t检验，P = 0.0008）（图6）。对于ST2分离株，在混合培养中产生的生物膜比纯培养中产生的生物膜少86%至89%（ST2-NY混合培养与纯培养的t检验，P = 0.0025；ST2-MS混合培养与纯培养的t检验，P < 0.0001），但ST59分离株的情况并非如此（ST59与ST2-NY混合培养与纯培养的t检验，P = 0.37；ST59与ST2-MS混合培养与纯培养，P = 0.59）（图6）。因此，ST59分离株减少了由ST2分离株产生的本来较高的生物膜（见补充材料中的图S2）。在光密度相近的培养物中，混合生物膜恢复了ST2和ST59每毫升相似的CFU值，这表明生物膜的减少不是ST59杀死ST2的结果。

图6 表皮葡萄球菌S. epidermidis在纯培养和混合培养中形成生物膜的能力。ST2和ST59菌株分别在纯培养物（红色为ST2，青色为ST59）或混合物（紫色）中单独生长。在492 nm 处测量24小时生物膜的结晶紫染色。每个条形代表4次重复的平均值和标准偏差。t检验用于比较纯培养物和混合培养物中的平均生物膜的值（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001）。

在第5至第8周，其中一个婴儿出现了腹部胀气，由于血氧饱和度降低而导致需氧量增加，以及气管导管分泌物增加，C反应蛋白轻度升高，尿量减少。腹部X线检查提示肠道积气，因此婴儿被怀疑有坏死性结肠炎。血培养结果为阴性，但在该婴儿第6周的粪便样本中，嗜麦芽单胞菌Stenotrophomonas maltophilia的相对含量达到92%，在该婴儿第6周的鼻拭子中也检测到相对含量<1%。该婴儿在第8周采样时没有产生粪便，但第8周的鼻拭子再次产生了相对丰度为24%的嗜麦芽单胞菌S. maltophilia。在我们的研究中，只有1个不同的婴儿和时间点的样本中出现嗜麦芽单胞菌S. maltophilia，其粪便中的相对丰度低于1%。如图3所示（下图，婴儿1），用万古霉素-阿米卡星和头孢他啶治疗被感染的婴儿。嗜麦芽单胞菌S. maltophilia的宏基因组组装显示，该菌株与多焦点序列140型有关，并携带对所有用于治疗的抗生素类的抗性决定因素，具体如下：革兰氏阴性细胞壁（固有糖肽耐药），aph（3’）-IIc（氨基糖苷耐药），blaL1（β -内酰胺耐药）和对6类抗生素具有有效的外排泵。

在该婴儿第6周的粪便样本中也检测到了罕见的ST5菌株，其在所有GRiD样本中复制率最高（1.56；图1B和C的指数中期），SMEG（1.73；图1B和C的尺度异常）。粪便样本中表皮葡萄球菌S. epidermidis的复制率倾向高于皮肤拭子（GRiD t检验，P = 0.056）（图7A）。这种不同体位的生长差异也反映在菌株水平上（SMEG值的t检验，P = 0.038）（图7B）。然而，2个身体部位的最高复制率都归因于ST5（图7B，灰色），去除ST5值后，身体部位之间平均复制率的显著差异消失了（SMEG值的t检验，P = 0.74）。由于在此期间血培养呈阴性，因此不清楚是嗜麦芽单胞菌S. maltophilia或表皮葡萄球菌S. epidermidis，还是其他病原体造成了婴儿的临床症状。然而，我们的数据表明，粪便中异常快速生长的表皮细胞菌株与这次发作有时间上的联系。

图7 早产儿皮肤和粪便样本中表皮葡萄球菌S. epidermidis的复制率。（A） 用GRiD测量的表皮葡萄球菌S. epidermidis的种级复制率。（B） 用SMEG测量的表皮葡萄球菌S. epidermidis的菌株级复制率。ST2以红色表示，ST59以青色表示，ST5以灰色表示，紫色表示仅出现在单个样本中的两个稀有ST。t检验用于比较身体部位之间的平均复制率（#，0.1 > P > 0.05；*，P < 0.05）。

在健康儿童出生后大于6周的阶段，不同身体部位的微生物开始分化和个性化。在健康的成年人中，CoNS物种甚至表皮葡萄球菌S. epidermidis在不同皮肤部位的分布存在差异。然而，早产儿的不同皮肤部位，特别是极低体重的婴儿，在出生后6周内可能没有生理上的区别，而且可能比成人皮肤更湿润。因此，皮肤微生物组的发展在早产儿中是延迟的，它可能受到出生方式、喂养习惯、抗生素暴露和NICU环境的影响。

在这项研究中，早产儿皮肤微生物组以表皮葡萄球菌S. epidermidis和头状葡萄球菌S. capitis为主，这2种细菌都是导致这一脆弱的宿主群体出现抗菌素耐药性感染的主要原因。我们没有观察到不同皮肤部位的微生物组多样性或组成的统计学上的显著差异。我们使用的基于标记的物种鉴定方法（MetaPhlAn2）具有较高的特异性，但相对于其他一些方法来说灵敏度较低。因此，虽然我们可以对大多数物种的识别有信心，但我们很可能错过了一些出现频率较低的物种。尽管如此，即使每个婴儿在本研究期间接受了多个疗程的抗生素治疗，我们确实观察到随着时间的推移，这些婴儿的皮肤上出现了更多样化的微生物群落，其中有不同的物种。尽管身体各部位的物种广泛共享，但皮肤和粪便的微生物群组成是相互区别的，这标志着身体各部位的微生物群开始分化。

多种菌株鉴定方法表明，最普遍的物种——表皮葡萄球菌S. epidermidis的种群是由两个主要的菌株组成。我们的研究结果提供了表皮葡萄球菌S. epidermidis菌株ST2和ST59之间拮抗作用的证据。在皮肤上，这些菌株与不同的物种共存，在不同的样本中复制最快。ST2较早在皮肤上定植，但随着时间的推移经常被ST59取代。在实验室条件下，我们发现ST2的参考分离物比ST59产生更多的生物膜，而且在混合培养过程中生物膜会减少。尽管实验室结果显示了ST2和ST59之间直接拮抗的可行性，但在早产婴儿的背景下，这种解释存在局限性，因为所使用的菌株不是从婴儿身上分离出来的，而且没有考虑潜在的间接因素，如微环境的改变。之前的研究表明，这些菌株在住院病人中比在非住院病人中更常见。ST2是一个著名的医院专科菌株，在全世界范围内引起抗生素耐药性感染。ST59的研究较少，但也是已知的抗生素耐药菌。

宏基因组组装显示，ST2和ST59菌株在氨基酸水平上编码了相同的agr I型序列。agr 群体感应系统是毒力基因表达的全局调节器，氨基酸多态性在表皮葡萄球菌S. epidermidis中至少区分了三种agr类型，这些类型被认为能抑制彼此的表达。在健康成人中，皮肤与不同agr类型的表皮葡萄球菌S. epidermidis菌株共生可能是常见的，这可能导致毒性较低的群体存在。相反，像我们研究中发生的那样，相同agr类型的菌株共同定植，预计会导致agr的激活增加，相关的降解酶和毒素的表达增加，生物膜的表达减少。不管拮抗的机制是直接的还是间接的，也不管agr是否有作用，我们的研究表明，即使是同一agr类型的表皮葡萄球菌S. epidermidis菌株之间也会发生拮抗作用。

对微生物组样本进行PMA处理以富集有活力的微生物组是本研究的一个创新点。虽然不能保证去除所有微生物非活DNA的效果相同，但我们表明，PMA处理实验室培养物有效地去除了非活的表皮葡萄球菌S. epidermidis的DNA。这些实验中使用的5×108 CFU/ml的表皮葡萄球菌S. epidermidis超过了婴儿皮肤上真实世界的微生物量的许多数量级。例如，在一项研究中，从新生儿手臂和腹股沟的2平方厘米拭子（如我们的研究中所做的）中得到的革兰氏阳性细菌的基线数量分别为155和65 CFU/ml。此外，在研究PMA去除表皮葡萄球菌S. epidermidis的纯化基因组DNA的能力时，我们在实验中使用了约250 ng，但我们处理的皮肤样本的总DNA的平均含量小于8 ng。

另一种重点研究可存活微生物群的方法是考虑微生物在原位生长。由于细菌染色体从起点复制到终点，并且在前几轮复制完成之前可以开始多次复制，因此靠近起点的序列的复制数与靠近终点的序列的复制数的比较给出了关于复制率的信息。此前使用这种方法的研究表明，在成年志愿者的鼻拭子中金黄色葡萄球菌S. aureus复制活跃。在这里，我们证明了拭子的PMA处理不会干扰这些估计，甚至对于表皮葡萄球菌S. epidermidis复制率的准确估计是必需的。另一项关于早产婴儿微生物组内细菌复制率的研究发现，来自（少数）皮肤样本的物种比来自粪便样本的相同物种生长得更快。我们基于存活率处理的结果显示了相反的结果，表皮葡萄球菌S. epidermidis在粪便中的复制率比在皮肤中的复制率要快。然而，这一结果是由于ST5菌株生长更快。表皮葡萄球菌S. epidermidis菌株在粪便中达到较高相对丰度的能力在以前的研究中已经被指出，但这种能力的临床相关性需要确定。

这项研究的一个局限性是，我们测量的是微生物的相对丰度，而不是它们的绝对丰度。影响物种相互作用的密度依赖现象，如细菌生长和群体感应，可能最好用绝对丰度数据进行评估。例如，Liu等人的研究表明，在成年双胞胎鼻腔微生物组研究中，绝对丰度数据对于检测金黄色葡萄球菌S. aureus与其他物种的相互作用至关重要。最近，有研究利用绝对丰度数据检测了早产婴儿粪便中表皮葡萄球菌S. epidermidis与肺炎克雷伯菌K. pneumoniae的相互作用。本研究的另一个局限性是微生物组采样之间的时间间隔为2周。采用这种方案，可能会错过超过2周的定植动态。

按照Hillmann等人的方案，本研究的测序水平（平均而言，皮肤拭子为5.9M读数，粪便样本为22.6M读数）介于浅层测序（0.5M读数）和深层测序（50M读数）之间。这种覆盖深度足以可靠地识别表皮葡萄球菌S. epidermidis的2个主要菌株，但对这些菌株的宏基因组组装却不太成功。对于复杂微生物群落来说，除了覆盖深度，覆盖广度也是的一个重要考虑因素。早产儿皮肤微生物组似乎没有健康婴儿或成人的那么复杂，主要是一些能在新生儿重症监护室环境中生长的物种。因此，适量的鸟枪测序数据似乎足以描述该患者群体中主要菌株之间的相互作用。

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