科研 | Microorganisms：患早期龋齿病和先天性心脏病的学龄前儿童的龋病微生物组分析

编译：微科盟蓝胖儿，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

20名学龄前儿童参与了这项研究。11名符合先天性心脏病（CHD）标准，其中2名为轻度CHD，9名为重度CHD。9名儿童为健康对照组（HCG）。两组在性别和龋病状况（dmf-t指数）方面基本平衡。CHD与HCG之间dmf-t指标无显著差异（p > 0.05）（补充材料表S1）。

所有儿童均表现出高龋病风险，并伴有牙本质龋损。根据IAPD，13名儿童出现S-ECC（图1）。6名患者临床出现炎症征象，显示瘘管/脓肿（图1），其中2名患儿为CHD。图2显示了CHD06患者的早期儿童龋齿S-ECC（dmf-t = 9）和下部第一磨牙区域瘘管（FDI#74），这表明深龋破坏后牙髓感染，需要拔除以避免并发症。

图1 每个先天性心脏病（CHD）患者或健康对照组（HCG）的dmf-t值柱状图。

 图2 CHD06患者患有严重的早期儿童龋齿（S-ECC）和龋齿74的瘘管（A）（红色圆圈标记），放射学显示由于牙髓感染导致慢性根尖周炎，需要拔除龋齿74（红色圆圈标记；B）和拔除龋齿74三年后复诊情况（红色圆圈标记；C）。 

两组患者在不同取样深度观察到的OTUs数量的箱线图显示了相似的平均值和中位数。虽然在CHD组观察到更大的变化，我们发现CHD儿童和HCG儿童之间在统计学上没有显著差异（图3A）。

基于Bray-Curtis差异的PCoA分析将CHD和HCG样本分为三组。第一组（CHD03、CHD04、HCG07）和第三组（CHD06、CHD07、CHD08、CHD09、HCG01、HCG02、HCG05、HCG06、HCG08、HCG09、HCG10）是CHD和HCG样本的组合，而第二组（CHD01、CHD02、CHD05、CHD10、CHD11）仅包含来自CHD儿童的样本。而样本HCG04未分配给三个组中的任何一个。AMOVA和HOMOVA在CHD和HCG样本中的总体变异没有显著差异。分成三组的样本显示出明显不同的形心（图3B）。

图3 在3000 reads采样深度下观察到的CHD和HCG儿童OTUs数量的箱线图（A）。CHD和HCG样品的Bray-Curtis PCoA差异（B）。 

在最高分类水平上，我们发现共有170个不同的分类群；其中62个样本的相对丰度大于1%。总的来说，我们在CHD和HCG样本中发现了大量的乳酸杆菌、奈瑟菌和链球菌。HCG中韦永氏球菌属的平均值是CHD的两倍。此外，欧陆森氏菌属和罗氏菌属在HCG中增加。相比之下，CHD组中放线菌属的平均含量是HCG组的两倍。此外，梭杆菌属在CHD样本中更丰富。

在第一组中，我们发现主要是乳酸杆菌属，在样本CHD04中，我们确定欧陆森氏菌属是最有可能的属。第二组的两个样本（CHD01和CHD05）的放线菌相对丰度较高。除此之外，我们还注意到一种更为多样的成分，包括数量更多的属和相对数量更小的属。其中棒状杆菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、普雷沃氏菌属、月形单胞菌属和韦荣球菌科最为显著。在第二组中，通过BLASTn将不同的月形单胞菌属鉴定为韦荣球菌科中最丰富的OTU。第三组以链球菌属和韦永氏球菌属为主。

此外，在至少一半的样本中，我们发现放线菌属、奈瑟氏菌属、乳杆菌属、欧陆森氏菌属和罗氏菌属是主要的属。对双歧杆菌科进一步鉴定，发现以类斯卡多维亚氏菌属、嗜血杆菌属和纤毛菌属为主，在至少一个实例中检测到每一种都超过10%。样品HCG04中主要为由黄杆菌科、葡萄球菌属和链球菌属。此外，我们发现普氏厌氧球菌和芽孢杆菌构成了其他属的主要类群（图4）。

为了进一步描述CHD和HCG组的微生物的独特组成，以及OTU水平上的三个类群，我们使用了LEfSe（图5）。对于CHD组，我们发现主要是梭杆菌属，普雷沃菌属、二氧化碳噬纤维菌属和颤杆菌克属的OTUs丰度显著更高。HCG样品显示乳杆菌属和罗氏菌属的单一OTU是显著的鉴别特征。

图5 LEfSe用于CHD与HCG的对比（A）以及基于Bray–Curtis的PCoA中观察到的三个类群（B）。三个类群之间显著不同OTUs的LDA得分（左），系统分类（中），以及显示每个OTU对数10转换相对丰度的热图（右）。

与我们在属水平上的结果一致，我们发现乳酸杆菌属是第一类群的主要特征属。第二类群中属的数量最多。这与我们观察到的更加多样化的成分相吻合。我们发现放线菌属、普雷沃菌属和月形单胞菌属的多个OTUs和梭杆菌属、棒状杆菌属和二氧化碳噬纤维菌属的单个OTUs表达有显著差异。第三组以韦永氏球菌属和链球菌属为主。

据我们所知，尽管其他研究小组已经描述了患者的微生物组，这是第一项使用新一代测序技术对患有先天性心脏病（CHD）的学龄前儿童与健康对照组（HCG）进行龋齿微生物组比较的研究。通过16S rRNA扩增测序技术，我们确定了CHD和HCG儿童牙本质病变的微生物群谱，并像文献中描述的那样，对几种与龋齿相关的菌属进行了检测。其中包括链球菌属、乳酸杆菌属、普雷沃菌属、韦永氏球菌属、双歧杆菌属、梭杆菌属、月形单胞菌属、棒状杆菌属、放线菌属、和氧化碳噬纤维菌属，这些属已被确定为与龋病的发生有关。

CHD患者和HCG患者之间的比较表明，在CHD组中，梭杆菌属、普雷沃菌属、二氧化碳噬纤维菌属和颤杆菌克属的丰度较高，而在HCG组中，乳酸杆菌属和罗氏菌属是独有的特征属。梭杆菌属在龋齿形成中起重要作用。事实上，在大多数儿童中发现了这种微生物，尤其是易患CHD的儿童，这一点值得人们关注，因为这些微生物可以进入全身循环并引起菌血症。其结果可能是产生有害的全身效应，可以促进疾病，因为口腔细菌是造成许多感染的原因，从而导致受影响儿童进一步的出现全身问题。我们通过Bray-Curtis的PCoA进一步研究了两个类群的个体是如何相互聚集的。第一组中乳杆菌属的单菌比率较高，而CHD中（第二组）由梭杆菌属、韦永氏球菌属、棒状杆菌属、放线菌属、普雷沃菌属和黄杆菌属组成。在第三组中，观察到了韦永氏球菌属、链球菌属和双歧杆菌属。

根据文献，在有深龋病变的牙髓感染中发现乳酸杆菌水平较低，与第一组受试者中存在的乳酸杆菌水平相似。也有人认为，乳酸菌数量的改变可能是由于由龋齿菌群转变为一种细菌组成，刺激进展到牙髓组织，导致感染。

此外，在第3组的11个个体样本中，有4个样本中显示有属于红蝽菌科的欧陆森氏菌属。NCBI rRNA数据库对V4测序结果的BLAST分析表明，Olsenella profusa是最匹配的。众所周知，欧陆森氏菌属会引起人类牙髓感染，如图2所示，这可能是CHD06出现脓肿的病因。虽然我们无法在大多数受试者中证明感染的临床征象（瘘管、脓肿），我们仍不能排除牙髓坏死伴早期牙髓感染已经发生在牙本质病变深度方面的可能性。

此外，在NCBI rRNA数据库的BLAST分析中检测并证实了与ECC相关的最丰富的物种是变形链球菌，并鉴定出了与龋齿发生有显著相关性的韦永氏球菌属和双歧杆菌属。这些结果与我们的临床结果一致，所有患者dmf-t值（S-ECC）均较高，5例患者（CHD06、HCG10、HCG08、CHD02、HCG04）出现临床炎症。此外，这两个属被称为牙齿表面的早期定殖菌，相互作用形成牙菌斑：链球菌属和韦永氏球菌属的发酵产物。

结果表明，三个组中细菌的多样性和组成存在差异。这些结果表明，口腔微生物群可能受到不同健康方面的影响。在我们的研究中，与第2组（CHD组）相比，第1组和第3组的口腔微生物群的差异更小。同时我们可以在CHD儿童群体中检测到高多样性的韦永氏球菌属。鉴于这些结果，可以假设CHD的某些方面可能影响口腔微生物组的组成。此外，鉴于其他研究中对龋齿、菌斑和唾液的种类进行了检查，可以假设龋齿病变的结果可以转移到整个口腔。此外，口腔定植似乎具有系统性影响。

牙科疾病与感染风险增加有关，这表明口腔中的细菌可能有助于炎症的发展。关于不良口腔的可能对全身健康的影响，这些应该考虑到感染的原因，如菌血症。因此，由此产生的有害影响可能导致儿童出现更多的全身健康问题。所以，预防口腔微生物组失调可能是降低患病儿童，特别是先天性心脏病儿童感染并发症风险的一项的措施。牙科疾病与感染风险增加有关，表明口腔中的细菌可能有助于炎症的发展。

本研究也存在一些局限性。在临床层面上，龋病诊断基于牙本质病变的临床评估。故主治医生在临床数据收集之前进行了校正，采用检验者内部校正（10名志愿者未被纳入研究）以验证诊断。因此，在诊断方面可以避免强烈的偏见。此外，两个队列的规模都是有限的；进一步的研究需要扩大群体规模来证实了这些初步结果。除了减少可能的扩增偏差外，还可以采用三重PCR反应。然而，由于受调查的小群体患者表现出差异，可以认为在我们的试点研究中，个体数量可能已经足够。由于有关儿童的微生物组和心脏病的文献有限，我们参考了有关成人的文献，因为研究结果也可能代表儿童的一种可能趋势。

我们的结果表明，牙齿健康似乎在整体健康中起着重要作用；这就需要对更多的心脏病患者和健康学龄前儿童进行进一步研究。

在初步研究的范围内，可以得出结论，CHD儿童和HCG儿童的牙本质微生物组不同。此外，我们观察到三组不同的微生物组，这表明需要对CHD个体进行更个性化的风险评估。因此，口腔健康似乎极为重要，特别是对弱势群体而言，而且似乎在可能出现的并发症方面发挥着重要作用。这些数据可以帮助我们了解学龄前儿童龋齿和牙髓感染相关的口腔微生物群落结构，从而了解这些高危患者的总体健康状况。

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