右美托咪定对口腔癌根治及重建术患者免疫应答的影响

       口腔癌是最常见的肿瘤之一，其5年生存率在过去几十年中一直保持在50%。在东南亚，口腔癌主要由咀嚼槟榔、吸烟和饮酒等引起。虽然它被视为老年人易患的一种疾病，但近年来全世界年轻患者的数量一直在增加。根治性切除和即刻重建是治疗口腔癌的主要手段。手术应激反应通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统直接诱发免疫抑制，手术后残留的肿瘤细胞可能因患者免疫力下降而转移。同时，一些麻醉药物对先天免疫和获得性免疫有直接的抑制作用。因此，围手术期选择合适的麻醉药物很重要。右美托咪定作为一种α2肾上腺素能受体激动剂具有镇痛、镇静、抗焦虑和抗交感的特性。一些研究表明，右美托咪定可以调节乳腺癌、结肠癌和胃癌根治术患者围手术期的免疫应答，但右美托咪定对口腔恶性肿瘤患者术中免疫反应的影响尚不明确。因此有学者开展了一项前瞻性随机对照研究，评价右美托咪定对接受口腔肿瘤根治及前臂皮瓣重建患者免疫应答的影响，研究结果以Effects of dexmedetomidine on immune response in patients undergoing radical and reconstructive surgery for oral cancer为题发表《Oncology Letters》杂志上。

目的  

本研究旨在探讨右美托咪定对接受口腔肿瘤根治及前臂皮瓣重建术患者免疫应答的影响。

材料与方法  

       患者与分组: 该研究于2018年9月至2019年1月在武汉大学口腔医院进行，研究遵从赫尔辛基宣言，经武汉大学口腔医学院伦理委员会（中国武汉；批准号IRB-2018B23）批准，并在中国临床试验注册中心（ChiCTR-1800018367）注册。所有受试者在试验前均提供书面知情同意书。ASAⅠ～Ⅱ级，年龄在30-70岁之间的患者被纳入研究。所有患者均在全身麻醉下进行口腔癌根治性和前臂皮瓣重建术。患者均无内分泌、免疫或循环系统疾病病史。其他排除标准包括患者有近期或同期化疗，围术期需要输血或接受围术期免疫调节剂治疗者。出现严重手术并发症（包括感染或二次手术）的患者也被排除在研究之外。使用计算机生成的随机列表将患者随机分配到两组，详细步骤如下：在将患者分配到组之前，计算机生成随机数，入选本研究的患者按随机数顺序分配，偶数进入对照组，奇数进入实验组。

麻醉方法：所有患者在麻醉前30分钟肌肉注射0.01 mg·kg-1阿托品，给予右锁骨下静脉穿刺监测中心静脉压，桡动脉穿刺监测实时血压。术中持续监测心电图、血氧饱和度（SaO2）、呼气末二氧化碳（PetCO2）和麻醉深度指数。在右美托咪定组，麻醉诱导前15分钟内注入0.5 μg·kg-1负荷剂量的右美托咪定，随后给予0.4μg·kg-1·h-1维持。根据其临床药代动力学和药效学，右美托咪定实际上应在手术结束前30分钟停用，但在本研究中，很难确定何时为手术完成前30分钟，因此，为了减少偏差，手术结束立即停止右美托咪定输注，以使每位患者的基线相同。对照组中给予患者相同体积的生理盐水。麻醉诱导采用静脉注射1.5-2.0mg·kg-1异丙酚，0.4μg·kg-1舒芬太尼，0.2mg·kg-1顺式阿曲库铵后给予经鼻气管插管。麻醉维持用药包括持续静脉输注2-3%七氟醚，0.2‑0.3μg·kg-1·min-1瑞芬太尼，及间断注射0.1 mg·kg-1顺式阿曲库铵。使用机械通气将PetCO2维持在35-40 mmHg及SaO2>98%。血压和心率在基线值±120%范围内波动。监测麻醉深度使脑电指数维持在40到60之间。每位患者在手术结束前30分钟给予0.1μg·kg-1舒芬太尼作为术后镇痛的负荷剂量，患者术后均接受静脉镇痛治疗。

外周血单核细胞分离：在五个时间点采集大隐静脉血（2ml）：诱导前30min（T0）、诱导后1h（T1）、手术结束时（T2）、术后24h（T3）和48h（T4）。外周血单核细胞在室温下用离心机在800 x g下离心20分钟。

流式细胞检测：外周血单核细胞在4℃用下列抗体染色30分钟：APC-eFluor 780-共轭抗CD45（clone:HI30;1:100）、AlexaFluor 700-共轭抗CD3（clone:UCHT1;1:50）、FITC-共轭抗CD4（clone:RPA-T4;1:200）、PE-Cy7-共轭抗CD8（clone:SK1;1:200）、PC5.5-共轭抗CD19（clone: SJ25C1;1:50），APC-共轭抗HLA-DR（clone:LN3;1:50），PC5.5-共轭抗CD14（clone:61D3;1:50）、PE-共轭抗CD15（clone:HI98;1:50）和BV421-共轭抗CD11C（clone:3.9;1:50）,并在4˚C下培养30分钟。4˚C时用活性染料Fixable Viability Dye eFluor™ 506染色排除死亡细胞。使用CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）进行检测，使用FlowJo10对数据进行分析。

观察指标：观察两组患者T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、树突状细胞和骨髓来源的抑制性细胞水平。使用RASS评分评价患者苏醒期躁动程度，评分≥2时认为患者发生苏醒期躁动，同时记录术中低血压和心动过缓的发生率。

 根据我们预实验T4时两组CD3＋细胞百分比，使用中国高智能化统计软件，假设I类错误为5%，检验效能为80%，每组需要29名患者，预计脱落率为10%，共招募了70名患者。所有统计分析均使用GraphPad Prism 7软件，数据以平均值±标准差或数值表示。采用χ2检验和Fisher精确检验比较性别、ASA分级和肿瘤分期的差异。非配对t检验用于比较年龄、BMI、手术时间、失血量和输液量。使用 ANOVA和Bonferroni校正法比较不同时间点两组之间免疫细胞百分比的差异。P<0.05认为差异有统计学意义。

结果  

比较两组之间的一般数据：共招募了70名患者，其中两名拒绝参加，每组有两名患者因输血而被排除在外。因此，每组纳入32名患者（图1）。

两组患者的人口统计学和手术情况相似。两组患者在年龄、性别、BMI、ASA分级、肿瘤分期、手术时间、失血量或输液量方面均无显著差异（均P>0.05；表1）。

       两组间T淋巴细胞亚群的比较：麻醉诱导前两组CD3＋、CD4＋细胞百分比及CD4＋/CD8＋比值无显著性差异（P>0.05）。与T0时的基线值相比，两组的CD3＋和CD4＋细胞百分比以及CD4＋/CD8＋比在T1-4时间点显著降低，与对照组相比，右美托咪定组在T1-4CD3＋和CD4＋细胞百分比以及CD4＋/CD8＋比显著升高（P<0.05）。在T0‑4两组间CD8＋细胞百分比无显著差异（P>0.05）（图2和补充图1）。这些结果表明，两组患者麻醉后细胞免疫功能均受到抑制，右美托咪定可能减轻这些患者的细胞免疫功能损害。

       两组间B淋巴细胞的比较：两组在T1‑4时的B淋巴细胞比率显著低于T0时的百分比（均P<0.05），但在同一时间点，两组之间差异不具有统计学差异（P>0.05）（图3）。这些结果表明，右美托咪定对口腔癌根治和重建术患者的体液免疫应答影响极小。

       两组树突状细胞的比较：与T0时的基线值相比，两组在T1-4时的树突状细胞百分比显著降低，右美托咪定组在T2-4时的树突状细胞百分比显著高于对照组（T2时分别为0.5±0.2% vs 0.3±0.2%,T3时分别为0.5±0.1%vs0.4±0.2%,T4时分别为0.6±0.2%vs 0.5±0.3%;P<0.05；图4）。这些结果表明，右美托咪定可能削弱对免疫应答的抑制并有利于抗肿瘤治疗。

       两组间骨髓来源的抑制性细胞的比较:相较于T0时的基线值，两组在T1‑3时的骨髓来源的抑制性细胞占比显著降低，右美托咪定组在T2‑4时骨髓来源的抑制性细胞占比显著低于对照组（T2时分别为2.6±1.4%vs 3.4±1.4%,T3时分别为3.2±1.1%vs 4.0±1.1%,T4时分别为4.2±1.1%vs 4.7±1%;P<0.05;图5）。这些结果表明，右美托咪定可能降低骨髓来源的抑制性细胞比并改善患者的免疫抑制状态。

        躁动、低血压和心动过缓发生率的组间比较：与对照组相比，右美托咪定组术后躁动的发生率较低（31.2vs 59.4%;P=0.044）。然而，右美托咪定组术中低血压和心动过缓的发生率显著高于对照组（P<0.05）(表Ⅱ)。

讨论   

       目前的结果显示右美托咪定降低了CD3＋、CD4＋和树突状细胞百分比，减少了CD4＋/CD8＋比值及骨髓来源的抑制性细胞的百分比，表明右美托咪定可以减轻口腔癌根治和重建术患者的免疫抑制。   口腔癌是东南亚国家中高发且威胁生命的重要疾病，根治性手术和即刻重建是常见治疗方法。手术应激反应被认为是通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统直接诱导免疫抑制，从而导致糖皮质激素和儿茶酚胺产物增加。众所周知，糖皮质激素可减少自然杀伤细胞的数量并抑制其活性，且呈剂量依赖地减少T细胞增殖。儿茶酚胺还可以通过降低IL-2的表达和分泌来抑制T细胞增殖并降低自然杀伤细胞的活性。同时研究报道，一些麻醉药对先天免疫和获得性免疫有直接抑制作用。   七氟醚是一种常用的吸入麻醉剂，它能够抑制自然杀伤细胞活性并诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞的凋亡。阿片类药物是手术中常用的镇痛药，通过抑制自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的活性以及抑制T淋巴细胞增殖发挥免疫抑制效应。手术和麻醉诱导的免疫抑制效应与术后感染性并发症和肿瘤转移的发生有关。   考虑到在癌症治疗中手术的必要性，已经开展了广泛的研究以确定麻醉药对免疫细胞群的影响。右美托咪定是一种高选择性α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、抗焦虑、镇痛和抗交感特性。Ebert等报告右美托咪定呈剂量依赖式使循环血浆儿茶酚胺浓度降低60-80%，这种降低与其持久的抗交感作用一致。其他研究表明，右美托咪定对缺血和缺氧损伤发挥抗炎和器官保护作用，也可调节免疫应答。

       细胞免疫与抗肿瘤作用和肿瘤转移监测密切相关。改善围手术期细胞免疫状态有助于减轻免疫抑制和增强抗肿瘤转移能力。T淋巴细胞在细胞免疫中很重要。所有用CD3＋标记的成熟外周血T淋巴细胞均由CD4＋和CD8＋T淋巴细胞组成。前者发挥细胞免疫功能，而后者识别并杀死肿瘤细胞。CD4＋/CD8＋比率的降低意味着细胞免疫功能下降。本研究表明，两组患者CD3和CD4细胞百分比以及CD4＋/CD8＋比率从T1到T4时间点显著降低，且对照组显著低于右美托咪定组。这一结果表明，麻醉后两组患者的细胞免疫功能受到抑制，右美托咪定可能减轻这些患者的细胞免疫功能损害。这些结果与先前的报道相一致。例如，Yang等发现，在根治性乳腺切除术中，右美托咪定组和对照组麻醉后淋巴细胞计数存在显著差异。最近一项对141名接受结肠癌根治术患者的临床试验结果表明，右美托咪定可以减少对T淋巴细胞亚群的抑制并减少炎症因子分泌。Wang等发现右美托咪定可以在术后24小时维持辅助性T细胞（Th1/Th2）比率平衡，并增加根治性胃切除术的患者Th1应答。手术后Th1/Th2比率下降提示细胞介导的免疫应答受到抑制。   B淋巴细胞产生抗体并介导体液免疫。手术诱导的免疫抑制主要通过对细胞免疫系统的影响发挥作用，其中T淋巴细胞受影响最大，B淋巴细胞数量无明显变化。在本研究中，麻醉后两组患者B淋巴细胞百分比略有下降，在T1-4时间点组间无显著差异。右美托咪定对口腔癌根治和重建术患者的体液免疫应答影响很小。需要进一步开展研究探索右美托咪定对恶性肿瘤患者术中体液免疫的影响。

       树突状细胞是Steinman于1973年首次发现的抗原呈递细胞，被认为是抗肿瘤免疫的关键因素。作为一种免疫监视细胞，树突状细胞可以有效地聚集和激活T细胞，抑制肿瘤发生和发展。树突状细胞的临床研究主要集中在治疗性癌症疫苗接种上，利用体外生成和携带肿瘤抗原标记的树突状细胞进行免疫治疗已被成功引入临床疫苗治疗方案，并已被证明是可行且有效的。本研究表明，从T2至T4时间点，右美托咪定组的树突状细胞百分比显著高于对照组。这一结果表明，右美托咪定可能削弱对免疫应答的抑制作用，有利于抗肿瘤治疗。   骨髓来源的抑制性细胞是具有免疫抑制能力的髓系来源的免疫细胞的子集。研究表明，骨髓来源的抑制性细胞抑制CD8＋T细胞并抑制T细胞分泌IFN-γ和IL-2。此外，骨髓来源的抑制性细胞抑制B细胞增殖和抗体产生，该细胞扩增与肿瘤进展相关。目前的研究表明，从T1到T3时间点两组患者骨髓来源的抑制性细胞百分比显著降低，表明手术切除具有抗肿瘤效应。从T2到T4时间点右美托咪定组患者的骨髓来源的抑制性细胞占比显著降低，提示右美托咪定可能降低骨髓来源的抑制性细胞占比并改善患者的免疫抑制状态。   使用RASS评分评估苏醒期躁动程度发现，相较于对照组，右美托咪定组出现躁动的发生率较低。这一结果可能与右美托咪定的镇静和镇痛作用有关。因此，患者在恢复期间更易耐受气管导管和其他不适。然而，相较于对照组，右美托咪定组患者低血压和心动过缓的发生率更高。这一结果与先前研究报道相一致，其原因与右美托咪定对交感神经系统的抑制效应有关。   本研究有一定的局限性：未测量临床结局和无癌生存时间。此外，尚未探讨右美托咪定免疫抑制作用的具体机制。因此，有待于开展细胞和分子水平的研究进行机制探究。可以通过分析免疫细胞探究转录因子和趋化因子的mRNA表达水平改变。   总之，右美托咪定减轻了CD3   ＋   、CD4   ＋   和树突状细胞占比及CD4   ＋   /CD8   ＋   比下降，并降低了骨髓来源的抑制性细胞的占比。因此，右美托咪定可以改善口腔癌根治和重建术患者的免疫抑制。   

点评 

       手术切除实体瘤仍然是目前治疗癌症的主要手段之一。然而令人担忧的是，围手术期患者可因生理应激、交感神经系统过度活跃等诸多因素导致免疫抑制，T细胞及NK细胞等肿瘤杀伤能力减弱。与此同时，在手术创伤愈合过程中骨髓来源抑制性细胞重塑，持续发挥免疫抑制作用，共同促进术后残余肿瘤生长以及肿瘤转移。围术期应激可通过激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴及促进儿茶酚胺释放诱导应激相关蛋白分泌，儿茶酚胺能信号的持续作用则促进肿瘤生长且加强转移肿瘤对程序性细胞死亡的抵抗。 右美托咪定作为一种高选择性α2受体激动剂具有镇静、镇痛和抗交感作用，可通过激活突触后2受体有效降低交感神经活性，影响下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动。现有研究报道，右美托咪定在围术期对免疫应答发挥的调控作用不一。有研究发现，右美托咪定可诱导根治性胃癌手术患者术中CD4+T细胞Th2向Th1转化，减轻手术应激导致的细胞免疫抑制，术后给予此类患者右美托咪定镇痛可减少PD-1在CD4+T细胞上的表达，并诱导CD4+的T细胞向Th1及Treg细胞分化，维持免疫稳态。卵巢癌啮齿类动物体内研究发现，右美托咪定一方面直接作用于NK细胞α2受体，促进术后NK细胞活性抑制肿瘤细胞生长，同时还可以直接作用于巨噬细胞α2受体促进IL-2分泌并诱导Th1细胞增加，增强免疫应答。然而，在乳腺、肺、结肠癌体外研究中发现，右美托咪定在抑制儿茶酚胺飙升和炎症反应的同时可能直接作用于乳腺、肺、结肠肿瘤细胞α2受体增强免疫抑制，促使肿瘤细胞转移生长。 本研究通过开展前瞻性随机对照研究，系统观察了右美托咪定对口腔肿瘤根治及前臂皮瓣重建手术患者不同类型免疫细胞群表达的不同调控作用及其对围术期患者血流动力学和术后躁动的影响。研究结果支持右美托咪定减轻口腔癌患者免疫抑制的保护作用。然而，右美托咪定对于口腔癌患者免疫应答发挥保护效应的具体分子机制、其保护效应的持续时长、以及其对患者生存率影响的考量，有待进一步开展大量临床及基础研究予以解答。 

原始文献：

Huang L, Qin C, Wang L, Zhang T, Li J. Effects of dexmedetomidine on immune response in patients undergoing radical and reconstructive surgery for oral cancer. Oncol Lett. 2021 Feb;21(2):106. doi: 10.3892/ol.2020.12367. Epub 2020 Dec 10. PMID: 33376539; PMCID: PMC7751342.

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