科研 | 天津大学：AHLs对15 ℃下厌氧氨氧化工艺的影响：脱氮性能、基因表达及宏基因组学分析（国人佳作）

编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

三个反应器的性能如图1所示。随着运行温度的降低，所有反应器中的TIN 去除率均下降。到第I阶段结束时（第36天），R1、R2和R3中的TIN去除效率分别从81.8%、80.5%和81.7%下降到25.0%、44.1%和44.7%（图1）。

然后在第Ⅱ阶段，分别将甲醇、C6-HSL和C8-HSL添加到R1、R2和R3中。在R2中，加入C6-HSL后出水NH4+-N和NO2--N减少，TIN去除效率平均达到64.4%，增加了20.3%。R3中加入C8-HSL后，出水NH4+-N和NO2--N略有下降，TIN的去除效率平均为48.2%，提高了3.5%左右。相反，添加甲醇的对照组仍然保持较低的TIN去除效率，平均为18.7%。

在阶段三中，反应器的流入底物浓度降低。R2和R3中TIN去除效率的平均值分别显著提高至74.8%和59.7%，远高于R1了21.1%。

当第Ⅳ阶段进水浓度继续降低时，R2中的TIN去除效率接近第Ⅲ阶段，平均为76.2%。对于R3，注意到TIN去除效率的平均值增加到74.6%，接近R2的值。然而，R1的对照组仍然保持平均25.6%的相对较低的TIN去除效率。

结果表明，投加C8-HSL或C6-HSL明显增强了15 ℃下的TIN去除性能，尤其是TIN分别增加到74.6%和76.2%，而对照组在整个运行过程中平均保持在22.2%。

EPS是一种由微生物分泌的高分子量生物聚合物，可以影响污泥的性质和生物处理的性能。污水处理系统中EPS的产生和组成受环境条件的影响，尤其是温度。当反应器在15 ℃运行时，R1、R2和R3中的EPS浓度从第I阶段到第Ⅳ阶段不断增加，如图2所示。此外，R1、R2和R3中的EPS浓度分别为161.5±1.4、176.4±1.5和209.2±2.5 mg/gVSS，在IV期结束时分别增加了19.8%、67.7%和121.2%。据报道，当温度从25.4 ℃下降到14 ℃时，部分硝化-厌氧氨氧化系统中的总EPS从92.5增加到234.1 mg/g VSS。群体感应（QS）调节是控制EPS产生的重要调节机制。在厌氧颗粒污泥系统中，Lv等人（2018）揭示了外源性AHLs 投加导致了丰富的EPS产生并增强了系统的有机物质去除和甲烷化的能力。本研究中，外源性AHLs在15 ℃下也显著增强了EPS的分泌。较高浓度的EPS将为微生物提供更多的营养和细胞外酶，然后可能将提高厌氧氨氧化细菌的活性并保障更好的脱氮性能。然而，研究表明高水平的EPS不利于基质传质和渗透，特别是在颗粒污泥中，这会影响颗粒污泥污染物去除能力和稳定性。本研究结果表明，适当提高EPS的浓度有利于厌氧氨氧化反应的细菌生长和去除性能。

此外，与R1相比，R2和R3中总蛋白质与总多糖的比率（PN/PS；图2b）有较高的增加。Zhu等人（2015）推测PN由于具有与阳离子更好的亲和力，而在微生物来桥接中发挥至关重要的作用。PN也可能有助于颗粒的形成和稳定性（Yao 等，2010），此外，He等人（2020）的研究表明当温度降低时，EPS含量升高并超过初始水平，而PN/PS值则呈下降趋势。因此，结果表明：R2和R3中观察到的较高PN/PS，反映了C6-HSL或C8-HSL改性后的系统在较低温度运行期间存在更完整的生物膜。

近年来，qRT-PCR检测分析已应用于基因表达研究。基因表达的转录水平是评估细菌活性的遗传标记。在这项研究中，分析了编码NIR、HZS、HZO作为遗传标记的厌氧氨氧化过程酶。

将第I阶段作为归一化基准，不同功能基因的相对水平如图3所示。在厌氧氨氧化反应中，由nirS基因编码的NO氧化还原酶（NirS）首先将NO2--N还原为NO。然后，厌氧氨氧化基因标记物hzsB和hzo编码的酶可以分别将NO和NH4+-N转化为N2H4，将N2H4转化为N2。与阶段一相比，R2中hzsB基因和R3中hzo基因的表达水平分别为14.93倍和2.98倍。同样，Tang等人（2019）研究了AHLs在厌氧氨氧化活性中的作用，研究表明在添加3-oxo-C6-HSL后hzsA基因的表达水平提高了大约24%。如补充材料中所述，与R1对照组相比，R2和R3中厌氧氨氧化活性的平均值分别提高了43.5%和89.7%。并且hzsB和hzo在R2和R3中的表达水平增强，这也表明外源添加物质对厌氧氨氧化活性的刺激。

图3 在不同运行阶段结束时，R1、R2和R3中功能基因(a)nirS、(b)hzsB、(c)hzo和(d)ccsB 的表达变化。

此外，细胞色素c生物合成蛋白（Ccs）可促进血红素转运到厌氧氨氧化体以确保其还原状态，对生化功能具有良好响应。一般来说，ccsB的功能基因参与细胞色素c合成酶的编码。本研究中，R2和R3中ccsB基因的表达水平比第I阶段增加了1.35和3.25倍，表明R2和R3的生化功能更加稳定。

总体而言，外源AHLs可以增强基因表达，使低温下厌氧氨氧化菌的活性增加，系统脱氮效果提高。

整个运行阶段三个反应器中微生物群落的相对丰度总结在补充材料中。Candidatus Kuenenia （4.77%）在R2中丰度较高，Denitratisoma （15.34%）和亚硝化单胞菌属Nitrosomonas （9.32%）在R3中丰度较高。结果表明，外源AHLs刺激了氮循环相关微生物，尤其是C6-HSL对厌氧氨氧化菌的作用和C8-HSL对硝化菌的作用，即氨氧化菌和反硝化菌。如补充材料所示，第Ⅳ阶段R2中ΔNO3--N/ΔNH4+-N和ΔNO2--N/ΔNH4+-N的平均比分别为0.22和1.36，接近理论化学计量系数，即0.26和1.32。这可能是由在R2中的优势属Candidatus Kuenenia引起的。同时，IV期末R3中ΔNO3--N/ΔNH4+-N和ΔNO2--N/ΔNH4+-N的平均值分别为0.20和1.12，远低于理论值。R3中主导的属Denitratisoma和Nitrosomonas可以解释这一趋势。

添加甲醇、C6-HSL和C8-HSL明显改变了微生物组成的结构，尤其是反硝化菌。如补充材料所示，Thauera的丰度从平均0.11%急剧增加到R1、R2和R3中分别为27.34%、6.74% 和17.59%。Thauera在三个反应器中的增加趋势可能是由于外源甲醇作为反硝化菌的可用碳源。至于反硝化菌，R1的比例从7.99%下降到3.90%，而R2和R3的比例分别从3.74%增加到12.25%和6.44%到15.34%。先前的研究已经证实，C6-HSL和C8-HSL与Denitratisoma的相对丰度呈正相关，与本研究的变化相对应。

通过LEfSe分析确定了对观察到的差异贡献最大的群体（p<0.05）。通过16S rRNA 扩增子测序检测到的微生物属的LEfSe比较确定了每个阶段结束时R1、R2和R3中具有显著差异丰度的属（图4）。R2中检测到的丰度差异的分类群数量最多（42），远多于R1和R3的29和26，说明C6-HSL添加对微生物群落结构的影响更大。

有趣的是，在运行阶段不同反应器中厌氧氨氧化细菌的优势属有所不同。Candidatus Brocadia是第I阶段R1中的优势属，而Candidatus Kuenenia分别在R1和R3（第Ⅲ阶段）和R2（第Ⅱ阶段）中含量最高。先前的研究证实，由于有机化合物的存在，Candidatus Kuenenia比Candidatus Brocadia具有更高的耐受性，这可以解释在R1中Candidatus Brocadia到Candidatus Kuenenia的厌氧氨氧化菌优势属的演替。至于R2和R3，Candidatus Kuenenia在添加C6-HSL或C8-HSL后成为优势。该结果表明C6-HSL或C8-HSL改性将有利于厌氧氨氧化菌的生长。

Thauera属含有异养反硝化细菌，在所有三个反应器中丰度均较高，尤其是在第Ⅳ阶段的R1和R2和第Ⅱ阶段的R3。甲醇的存在可能促进了Thauera的增殖。此外，与异养反硝化作用相关的Denitratisoma在R2（第Ⅲ阶段）和R3（第Ⅳ阶段）中也以相对较高的丰度存在。在II-IV阶段，R2和R3中ΔNO3--N/ΔNH4+-N的平均比率分别为0.24和0.25，略低于理论化学计量比0.26。R3中Denitratisoma和Nitrosomonas的主导可以解释这一趋势。

改性操作引起了三个反应器微生物群落结构中可识别的变化，特别是反硝化菌的丰度和性质，进一步影响了脱氮性能。

通过构建共现网络揭示了细菌属之间的潜在相互作用。强（p>0.8）和显著（p<0.05）共现相关性如图5所示。一般地，一个节点关联的边越多，表明与拥有该节点的种群有更多潜在的细菌相互作用。根据生态功能将细菌属分为六类，即厌氧氨氧化菌、反硝化菌、硝化菌、发酵菌、其他异养菌和未分类菌。

在所有反应器中均能观察到厌氧氨氧化细菌和非厌氧氨氧化属之间的显著相关性。Candidatus Brocadia与Litorllinea、SM1A02和Haliangium在R1中存在显著相关性，而Candidatus Kuenenia与R2中的Fluviicola显著相关。在R3中，Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia与其他属显著相关。如上述LefSe分析，Candidatus Brocadia是R1中丰富的厌氧氨氧化属，而Candidatus Kuenenia是R2和R3中观察到的主要厌氧氨氧化属。该结果表明C6-HS或C8-HSL改性改变了厌氧氨氧化细菌与其他细菌之间的相关性，此外，Candidatus Kuenenia对AHLs的添加更敏感。先前的一项研究表明，Candidatus Kuenenia在低温下比Candidatus Brocadia更具优势。因此，引入C6-HSL或C8-HSL加强了Candidatus Kuenenia的优势地位，可能促进了厌氧氨氧化反应器的低温性能。

研究采用基于微生物的COG（直系同源群簇）注释的功能分类用于探索R1、R2和R3中微生物代谢的差异（图6a）。基于不同COG的丰度，通过宏基因组分析确定了当前研究中反应器代谢潜力的差异（图6a）。与复制、重组和修复相关的COG在R1、R2和R3中最为丰富（分别为8.18%、9.05%和9.56%），其次是与能量生产和转换相关的COG（6.95%、7.12%和7.19%），以及与细胞壁/膜/包膜生物合成相关的COG（分别为6.46%、6.34%和6.88%）。Bao等人（2020）表明，土壤微生物中复制、重组和修复以及信号转导机制的基因数量在低温下显著减少。本研究中，外源性AHLs对复制、重组和修复基因的刺激作用远高于R1，表明R2和R3细胞的活性更高。此外，R1、R2和R3中碳水化合物转运和代谢的相对丰度分别为3.93%、4.07%和3.84%。可见外源性C6-HSL略微增强了碳水化合物的转运和代谢途径，这可能与KEGG中的氨基糖和核苷酸糖代谢途径（map00520）有关，同时外源性C6-HSL参与了PS的合成，因此，它可能有助于厌氧氨氧化细菌抵抗寒冷的温度。

图6 引入C6-HSL或C8-HSL后代谢途径的变化。(a)R1、R2和R3宏基因组的COG功能分类。(b)编码TCA循环关键酶的基因的相对丰度。(c)氨基糖和核苷酸糖和(d)在反应器中鉴定的氨基酸（Val、Leu、Ile、Asn、Ala、Gly、Cys和Met）的代谢途径。(e)氨基糖和核苷酸糖和氨基酸代谢途径中的基因丰度热图。(f)与氨基糖和核苷酸糖和氨基酸代谢途径相关的相对基因丰度。白色表示不相关，红色表示正相关，蓝色表示负相关。代谢物的缩写总结在补充材料中。

此外，参与三羧酸（TCA）循环的功能基因的相对丰度如图6b所示。TCA循环相关基因在不同反应器中存在一定差异。R1、R2和R3中frd的相对丰度分别为0.12%、0.12%和0.11%。R3中suc、fum和mdh基因的相对丰度分别比R1和R2高0.10%、0.11%和0.05%。suc、fum和mdh基因分别编码琥珀酰辅酶A合成酶、延胡索酸水合酶和苹果酸脱氢酶。特别地，mdh基因是TCA循环中必不可少的基因，它使用NAD+将苹果酸转化为草酰乙酸并产生NADH。参与TCA循环的几种有机酸，例如琥珀酸、酮戊二酸和草酰乙酸，被进一步转化为氨基酸，例如Glu、Asp、Pro和Arg。TCA循环中suc、fum和mdh的增加趋势可能会促进氨基酸的产生，进一步提高蛋白质的产生，进而提高厌氧氨氧化菌的活性和脱氮性能。

图6c显示了一些与氨基糖和核苷酸糖代谢相关基因的研究结果。据观察，C6-HSL提高了glmS基因的丰度，可能会增强GlcN-6P的产生。此外，C8-HSL明显提高了UAP1、glmU、pgi、tal-pgi、galT、arnA、arnB、arnC和arnD的基因丰度，有望增强参与氨基糖和核苷酸糖代谢的代谢物的产生，尤其是UDP-Gal和UDP-GLcNAc，其与PS产生有关。据报道，GlcN-6P是氨基糖代谢的中心底物，它是各种代谢途径的枢纽，如谷氨酰胺和谷氨酸代谢、糖酵解以及细胞壁合成等。此外，GlcN-6P随后被glmM基因异构化为GlcN-1P，并进一步被glmU基因转化为UDP-GlcNAc。此外，UDP-GlcNAc在细菌肽聚糖的组成以及革兰氏阴性菌的脂多糖中扮演重要角色。虽然EPS的合成涉及复杂的过程，UDP-Gal和UDP-GLcNAc合成基因的上调将有助于PS的产生，并进一步促进EPS的合成。

此外，图6d还研究了氨基酸生物合成途径，包括Val、Leu、Ile、Asn、Ala、Gly、Cys和Met。氨基酸是生物体生长、繁殖和维持的重要元素。此外，氨基酸具有巨大的生理重要性，可作为合成蛋白质和低分子量物质的基石。与对照组相比，C6-HSL提高了leuD、ilvD、alaA、ilvA、CHT、patB和methH的基因丰度，直接有利于Leu、Cys和Met的产生。同时，外源C8-HSL提高了ilvE、ilvD、ilvH、ilvE、leuA、leuB、leuD、cysE和metE的丰度，可能直接促进了Leu、Ile、Val、Ser和Met的生物合成。事实上，观察到C6-HSL和C8-HSL的添加同时上调了Leu和Met生物合成，这可能促进 EPS中的蛋白质合成。

冷应激主要引起氨基酸代谢和碳水化合物代谢的代谢变化。因此，适当浓度的C6-HSL或C8-HSL将上调涉及氨基糖和氨基酸生物合成途径的基因比例，进一步提高PN和PS的基本组成氨基酸、氨基糖和核苷酸糖的生成。总体而言，这将有利于EPS的分泌。

C6-HSL和C8-HSL改性可以提高厌氧氨氧化反应器的性能，促进EPS的产生，并在15℃下提高基因表达水平，尤其是hzo、hzsB和ccsB基因。用C6-HSL或C8-HSL改性的反应器的宏基因组具有更高丰度的与Leu和Met生物合成以及UDP-Gal和UDP-GLcNAc合成相关的基因。总之，C6-HSL或C8-HSL改性导致与硝化和厌氧氨氧化过程相关的基因表达升高，EPS产量增加，代谢相关基因丰度上调，进一步提高了15 ℃下厌氧氨氧化生物反应器的生物脱氮效率。