科研 | Nature：人类肠道细菌对治疗性药物的生物积累

编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

为了增加我们对细菌对药物利用度影响的认识，我们系统地分析了15种人类靶向药物与25种具有代表性的人类肠道细菌菌株之间的相互作用（附表1）。本研究所选择的细菌种类涵盖了代表健康微生物菌群的广泛系统发育和代谢多样性的微生物类群（补充图1a，附表1）。在药物方面，本研究选择了12种可以通过超高效液相色谱-紫外检测（UPLC-UV）进行定量分析的口服小分子药物（分子量小于500 Da），以涵盖不同的化学特性、适应症和副作用（补充图1b-e，附表2）。此外，我们纳入了3种额外的药物作为对照：分别是地高辛（digoxin）--与迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta，E. lenta）具有高度特异性相互作用；甲硝唑（metronidazole）和柳氮磺吡啶（sulfasalazine）--由几种肠道细菌代谢产生。

在两个独立的筛选中，我们共得到的375个细菌-药物对以探究他们对药物的消耗。细菌在肠道微生物组培养基（GMM）中生长，并给予50 μM的初始药物浓度，该药物浓度接近于所估计的许多药物在结肠中的浓度范围，并允许对这些药物可靠地进行浓度变化的测定。在厌氧生长48 h后，基于UPLC-UV方法测定了每对细菌-药物对的培养物上清液中药物的消耗（见方法）。经验证试验，对照药物甲硝唑和柳氮磺吡啶能够被大部分菌株耗尽，而地高辛仅被E. lenta耗尽。采用伪发现率（FDR，校正的P < 0.05以及> 30%的消耗阈值；附表3）来定义相互作用（基于E. lenta对地高辛的消耗作为具有确定体内相关性的病例）。此外，对于在筛选中所发现的所有新的相互作用，我们在扩大体积的培养物中进行独立试验来进一步评价这些相互作用（补充图2）。第二项试验中，具有统计支持的相互作用，以及具有之前研究支持的相互作用，揭示了一个涵盖所有测试菌株和66%测试药物（15个中的10个）的网络（图1）。据我们所知，其中29个相互作用（18种和7种药物）之前未报告。

图1 肠道细菌在不改变药物的情况下对治疗性药物的积累。本研究中发现的细菌-药物相互作用网络。左侧网络：肠道细菌对药物的生物转化或生物积累。显示了在两个独立筛选中显著（每个筛选n = 3个技术重复）、并在随访试验中验证（n = 3个生物学重复）的相互作用（P < 0.05），该网络还包括之前报告的在筛查中检出但未在验证试验中检测到的相互作用。右侧网络：在至少两个独立筛选中检测到的药物对肠道细菌生长的影响（α = 0.05），OD578nm代表在578nm处的光密度值。文中其他地方未提及的细菌全称如下：脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）、Bifidobacterium animalis subsp. lactis BI-07、Coprococcus comes、鲍氏梭菌（Clostridium bolteae）、Clostridium ramosum、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）。

为了追踪耗尽药物的命运，我们测量了生长后培养基上清液以及包括细胞在内的总培养提取物中药物的浓度（见方法）。值得注意的是，直到现在大家仍在公认，生物转化是细菌耗竭药物的主要方式。但本研究中，经过比较我们发现，在17个相互作用对的上清液中，其药物被耗尽，但能在总培养提取物中得以恢复（附表3）。这意味着细菌对各自药物存在的是积累过程而不是化学转化过程。

在29个新发现的相互作用中，多达17种（14种和4种药物）都存在生物蓄积情况，即细菌储存药物而不对其进行修饰。其余12种相互作用（8种和5种药物）可能代表生物转化过程。5种药物中的2种--左旋咪唑（levamisole）和依折麦布（ezetimibe）--确实被证明可被其他肠道细菌进行化学修饰。在生物蓄积药物中，抗抑郁药物度洛西汀（duloxetine）和降糖药罗格列酮（rosiglitazone）是仅发生生物蓄积的药物，其可发生在不同的菌种当中（图1）。然而，生物降解和生物蓄积相互作用并不相互排斥。孟鲁司特（Montelukast，用于治疗哮喘）和罗氟司特（roflumilast，用于治疗慢性阻塞性肺疾病）既能被一些细菌生物蓄积，也能被其他细菌降解。在细菌方面，除具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）外，所有菌株均表现出两种相互作用。除了与存在广泛相互作用的对照药物柳氮磺胺吡啶和甲硝唑之间的相互作用外，单形拟杆菌和大肠杆菌的同种菌株在其相互作用上没有出现重叠。由于不同个体通常携带不同的菌株，生物蓄积相互作用的发生率可能高于本研究所提及的发生率。

由于许多人类靶向药物已被证明能够影响肠道细菌的生长，我们进一步探究了本研究所鉴定出的细菌-药物相互作用是否也会影响细菌的生长。尽管检测到超过30个药物-细菌相互作用（其中主要都表现出抑制性），但只有3个药物-细菌相互作用同时涉及生长的调节和药物浓度的改变（这里所涉及的药物不包括对照药物柳氮磺胺吡啶和甲硝唑）（图1，附表3）。因此，细菌-药物和药物-细菌的相互作用似乎在很大程度上是独立的。

我们利用核磁共振（NMR）光谱法和液相色谱串联质谱法（LC-MS）两种方法，进一步证实了已鉴定的细菌-药物相互作用的生物蓄积性质。以度洛西汀（一种广泛使用的抗抑郁药）为例，我们发现其可被8种细菌生物积累。基于NMR光谱对度洛西汀进行测定，我们证实了我们所选的4种菌株（唾液链球菌[Streptococcus salivarius]、单形拟杆菌[B. uniformis]、大肠杆菌IAI1[E. coli IAI1]和大肠杆菌ED1a[E. coli ED1a]）能够将其在培养过程中被耗尽，而未对其进行生物转化（图2a-b，补充图3-4）。为了避免GMM培养基的复杂性，本研究采用PBS重悬细菌细胞进行进一步实验。尽管两种大肠杆菌菌株中仅一种（E. coli IAI1）在GMM中发生可观的生物蓄积，但在营养缺乏的条件下，我们发现度洛西汀能够被两种菌株所消耗殆尽。复杂GMM培养基中进行的LC-MS分析也证实了Clostridium saccharolyticum和E.coli IAI1能够在一系列度洛西汀浓度下（30至70 μM）发生生物积累（图2c，补充图5）。

图2 度洛西汀的生物积累会影响细菌的生理学。a代表采用核磁共振（NMR）技术分析显示唾液链球菌对度洛西汀的生物蓄积，其中在无血清的上清液中测定药物含量；b代表用50 μM度洛西汀处理后，采用NMR定量分析了三种肠道细菌菌株上清液中度洛西汀的含量（药物处理包含4个独立的生物学重复，无药物对照处理包含2个技术重复，无细菌对照处理包含7个独立的生物学重复），ND表示未检出峰，其中a-b中的生物积累实验均在PBS缓冲液中进行；c代表在不同初始药物浓度下，在GMM培养基中采用LC-MS法测定了度洛西汀在C. saccharolyticum体内的生物积累（n = 4个生物学独立重复）；d代表采用度洛西汀结合或酶应答标记的C. saccharolyticum体内核苷酸生物合成途径以及差异分泌代谢物（下划线），其中AMP代表腺苷-5'-单磷酸，FGAM代表5'-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨脒，GAR代表甘氨酰胺核糖核苷酸；FGAR代表N-甲酰-GAR，GMP代表单磷酸鸟苷，IMP代表单磷酸肌苷，PRPP代表5-磷酸核糖基1-焦磷酸，XMP代表黄嘌呤核苷5'-磷酸；e代表采用热蛋白质组分析表明，大肠杆菌IAI1（在GMM培养基中能够生物积累度洛西汀）和大肠杆菌 ED1a（在GMM培养基中不能够生物积累度洛西汀）对度洛西汀的应答存在差异，其中主图代表在进行TPP前将度洛西汀加入完整细胞中（共1,437种蛋白），插图代表药物加入细胞裂解物中时得到TPP结果（共1,694种蛋白），黑线代表对角线，蓝线代表线性回归拟合曲线；f代表度洛西汀处理对6种肠道细菌菌株胞外代谢组的影响（代谢组学采用非靶向HILIC-MS方法进行），虚线箭头表示度洛西汀诱导的C. saccharolyticum胞外代谢组变化；g代表度洛西汀诱导的C. saccharolyticum胞外代谢组的变化具有浓度依赖性。

尽管生物转化可归因于代谢酶的作用，但却很难在机制上对药物的生物积累进行描述。之前在诸如土壤或活性污泥生物反应器在内的其他生态系统中也观察到了非靶向微生物的小分子的生物积累现象。为了研究肠道细菌药物生物积累的分子基础，我们开始在生物蓄积的菌株中确定度洛西汀的蛋白靶标。我们从构建用作烷基化的诱饵、“可点击”分子版本开始（补充图6a，见方法）。与药物处理的对照相比，55种蛋白质（主要是代谢酶）在C. saccharolyticum裂解物的下游中富集（log2转换的倍数变化≥2，FDR调整的P < 0.1）（附图6b，附表4）。尽管这些结果强烈表明度洛西汀能够与特定的蛋白靶标相结合，但使用结构修饰版本的分子排除了直接结论。因此，我们还使用热蛋白质组分析（TPP）系统地确定暴露于未修饰的度洛西汀后发生结构变化（在热诱导去折叠方面稳定或不稳定）的蛋白质。TPP的分析结果支持了基于点击化学所得到的分析结果，该结果揭示了能够响应度洛西汀结构的蛋白质中的几种代谢酶（附表5）。受影响的途径包括氨基酸代谢、嘌呤和嘧啶生物合成以及为核苷酸生物合成提供前体的磷酸戊糖途径（图2d，附表5-6）。其中许多蛋白属于NADH–泛醌脱氢酶复合物，并含有与核苷酸结合相关的Rossmann折叠（附表5）。

点击化学和TPP结果表明，蛋白结合促进了度洛西汀的生物蓄积。由此我们提出这样一个问题：为什么两种不同的大肠杆菌菌株在GMM中表现出不同程度的度洛西汀生物积累。我们在两种不同的TPP试验（药物要么加入到细胞裂解液中，要么加入到完整细胞悬浮液中）中比较了两种大肠杆菌菌株。虽然在细胞裂解物中进行的TPP分析可发现由于度洛西汀直接结合而稳定或不稳定的蛋白，但在体内条件下，完整细胞的TPP分析还可捕获细胞响应的变化（蛋白相互作用以及活性的变化）。在完整细胞试验中，生物累积菌株（E.coli IAI1）的药物响应蛋白几乎是非生物累积菌株（E. coli ED1a）的两倍（388 vs 222蛋白），并且热稳定性的总体变化更强（图2e，附表5）。与度洛西汀能够更显著的改变生物蓄积菌株的细胞生理学相一致，E.coli IAI1菌株在差异表达蛋白方面中也表现出更明显的应答（补充图6c-d，附表7）。相比之下，两种菌株在基于裂解物进行的TPP中表现出非常相似的特征，这可能是由于裂解物中缺乏细胞外膜，这导致了度洛西汀能够接触到所有细胞内蛋白（397 vs 412蛋白）（图2e）。因此，这两种菌株所表现出的特异性可能归因于其各自摄取和外排系统的差异所致，这与药物相互作用中观察到的转运蛋白依赖性特异性结果相似。

度洛西汀与代谢酶的结合表明发生生物蓄积的细菌中代谢的改变。为了验证这一点，我们使用了两个互补的代谢组学平台--流动注射分析质谱（FIA-MS）和亲水作用色谱串联质谱法（HILIC-MS/MS）--来探究度洛西汀处理对6种细菌菌株（4种生物蓄积菌株和2种非生物蓄积菌株）小分子分泌的影响。在GMM培养集中，在药物处理后，有4个菌株【3个生物积累菌株[C. saccharolyticum、副干酪乳杆菌和大肠杆菌IAI1]和1个非生物积累菌株[乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）]】的胞外代谢组模式发生显著变化（P < 0.05）（图2f，补充图7，附表8-9，12A）。其中Clostridium saccharolyticum的变化尤其显著，其外代谢组的药物诱导变化与种属间差异相当（图2f）。此外，我们发现药物反应表现出浓度依赖性（图2g，补充图7b-c），对非生物积累的罗氟司特无影响（补充图8a）。基于71种代谢物的子集我们进一步验证了度洛西汀的浓度依赖性应答效应，同时使用串联质谱法分析了假定的化学特性--基于化学标准来确认两种代谢物（见方法，补充图8b，附表10）。在营养缺乏的PBS缓冲液中，C. saccharolyticum显示出对度洛西汀的强烈代谢反应（附表11，12b，图2d，补充图6e-h）。总之，蛋白质组学和代谢组学的数据表明，度洛西汀能够与丰富的代谢酶相结合，支持其在细胞内的储存。

代谢相互作用是形成肠道微生物群落组成的基础。因此，我们想要了解，与生物积累相关的代谢变化是否会影响群落组成。为了探究这个问题，我们在度洛西汀存在与否的条件下，构建了由5种肠道细菌构成的（Bacteroides thetaiotaomicron、直肠真杆菌[Eubacterium rectale]、格氏乳杆菌[Lactobacillus gasseri]、Ruminococcus torques和唾液链球菌[Streptococcus salivarius]）稳定群落。这5个细菌属中有1个是度洛西汀生物积累生物（唾液链球菌），有一个细菌属能够直接被度洛西汀抑制（直肠真杆菌）。将5个菌种共同接种于GMM中，随后每48h转移至新鲜培养基中一次。度洛西汀的存在显著改变了群落组成，使直肠真杆菌的丰度比无药物时增加了100倍以上（图3a，补充图9a-b）。值得注意的是，我们所选择的5个菌种中，直肠埃希菌对度洛西汀的敏感度最强（图3b，附表13）。与唾液链球菌作为生物积累菌株相一致，度洛西汀在群落的上清液中被耗尽（减少约15%）（补充图9c）。尽管度洛西汀浓度降低可保护群落中的直肠埃希菌，但在度洛西汀存在的情况下，直肠埃希菌的盛行需要促生长的相互作用。

我们假设唾液链球菌对度洛西汀应答的代谢产物分泌变化可促进直肠埃希菌的生长。在药物存在的条件下，利用唾液链球菌生长后的培养基去培养直肠埃希菌，我们发现这种条件下改善了直肠埃希菌的生长（图3c），这一结果支持了我们的假设。基于FIA-MS和HILIC-MS/MS的非靶向代谢组学数据进一步支持了我们交叉喂养假说。相应地，在唾液链球菌的培养过程发现的增加的几种代谢产物，在随后直肠埃希菌培养生产过程中被消耗殆尽（图3d，补充图9d，附表14，15）。基于分析标准品对代谢物进行注释，我们在5种代谢产物中确定了其中的2种--亚麻酸和甘氨胆酸（见方法）。核苷酸相关代谢物（如尿苷-5'-二磷酸）的变化与受度洛西汀影响的蛋白质和代谢物一致（图2d），并与直肠真杆菌挑剔的性质相一致。因此，人类靶向药物不仅可以通过直接抑制来影响肠道微生物，还可以通过创造交叉摄食的机会来调节肠道微生物群落。

 图3 度洛西汀生物蓄积改变了群落组配和宿主响应。a代表度洛西汀能够影响微生物群落组配。每48h将5种细菌的起始混合物转移至含有度洛西汀与否的新鲜培养基中（方法）。图中显示了基于16S rRNA扩增子测序估计的平均相对丰度曲线（进行三次生物重复）。明显的初始不均匀分布是由于细胞裂解和基因扩增效率导致的种间差异。将直肠埃希菌（E. rectale）的趋势归一化为扩展数据图9b中的接种物信号；b代表在a中所涉及的5种菌属在单独培养条件下对度洛西汀的敏感性评价，对于每一个接种物的浓度，都进行3尺独立的生长曲线测定，图中圆圈代表其平均值；c代表在唾液链球菌生长使用过的培养基中对直肠肠球菌进行培养，图中以OD578nm进行测定，在唾液链球菌生长前（药物调控）和唾液链球菌生长后（消耗调控）均在培养基中添加度洛西汀（n = 9，三个生物重复及三个技术重复）；d代表在无细胞的GMM培养基培养条件下，S. salivarius培养过程中增加的代谢物图谱以及随后用S. salivarius培养结束后的培养基对E. rectale进行培养，并测定了培养过程中减少的代谢物图谱（一共956个，非靶亲水作用色谱法串联质谱[HILIC-MS]分析，详细见方法），这意味着存在交叉饲喂，较粗的线标记使用HILIC-MS/MS推测归属的5种代谢物，其中2种（亚麻酸和甘氨胆酸）根据分析标准品确认。显示了3份生物重复样品的平均强度；e代表大肠埃希菌IAI1（生物蓄积）或大肠埃希菌ED1a（非生物蓄积）存在与否的情况下，用0.5 mM度洛西汀对LB培养基进行预处理，随后在预处理后的培养基中显示运动的蠕虫的百分比（n = 8[第三列和第5列，4个生物重复*2个技术重复]或n = 12[其他的列，6个生物重复*2个技术重复]，条形高度标记平均值；误差条显示使用单因素ANOVA估计的s.d. P值，随后校正多重成对比较（Tukey检验）。度洛西汀测量结果见扩展数据图9f。

进一步，我们利用线虫作为模型系统研究了度洛西汀生物蓄积对宿主响应的影响。度洛西汀作为一种5-羟色胺-降肾上腺素再摄取抑制剂，以浓度依赖性方式调节线虫的行为（肌肉运动）（补充图9e）。随后，在生物积累物种（大肠杆菌IAI1）存在的情况下（作为线虫生长培养基的一部分），我们检测了动物运动作为其行为读数。作为一个密切相关的对照，我们在复杂生长培养基中不具有生物积累的菌株--大肠杆菌ED1a作为对照。事实上，仅度洛西汀生物累积菌株IAI1减弱了度洛西汀对宿主的作用（图3e，补充图9f）。尽管线虫肠道被兼性厌氧菌和专性需氧菌定植，我们的结果与厌氧培养实验中观察到的生物积累完全一致。因此，需要在其他模型系统或临床环境中进一步研究微生物组-度洛西汀-宿主之间的相互作用。

我们的结果揭示了由于肠道细菌的生物蓄积可以调节宿主靶向药物治疗效果的两种方式：通过降低药物可用性的主要效应以及通过改变代谢物分泌的次要效应。后者可导致群落组成的变化，这与副作用甚至一些药物的作用方式有关。对于我们所举例的药物度洛西汀，肠道细菌相互作用确实涉及如体重增加在内的副作用，也涉及其作用方式。更广泛地说，我们的研究提出了肠道细菌-药物之间相互作用的系统构想：药物可以对微生物造成影响，同样微生物也可以对药物产生生物转化或生物积累效应，这两种相互作用既可单独测量直接效应，也可在群落中估计继发效应。