检验视界 | 急性炎症期间SAA分布及HDL结构的显著变化

【背景】

  高密度脂蛋白（HDL）是一种多功能颗粒，已被大量的流行病学和实验研究证明可以抑制动脉粥样硬化的进展。在冠心病所有的危险因素中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低是独立的的危险因素之一，无论低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平如何，HDL-C均与冠心病和中风的发病率呈反比。但是，由于HDL颗粒中蛋白质的种类和含量有很大的差异，导致HDL的作用如胆固醇逆转运、抗氧化、抗炎作用均有较大差异。因此确定HDL中蛋白质种类和含量对准确评价HDL的心血管保护作用具有很重要的作用。   血清淀粉样蛋白A（SAA）是一类急性相蛋白,主要与高密度脂蛋白结合而发挥作用。SAA在机体多种组织内均有转录和表达,结合多种不同细胞因子,多途径参与并影响机体病理和生理过程。SAA表达改变不仅出现在炎性疾病中,更是出现在一些肿瘤等非炎性疾病中。SAA在多研究中被提及可以作为骨关节炎症和骨肿瘤的生物标志物。  

  最近的研究表明，血清淀粉样蛋白A（SAA）不仅可以重塑HDL，而且可以诱导动脉粥样硬化以及慢性炎症。然而，这方面的研究很少。在本研究中，我们分析了接受骨科手术诱导急性炎症患者的HDL快速、依赖SAA的特征变化。

【方法】

  收集13名接受骨科手术的健康患者在手术前（PRE）、手术后（POST）、术后（POD）1、3、6或7天的血液样本，在东京医科大学医学院附属医院临床实验室进行实验室分析。 采用超速离心法从患者血浆样品中分离出 HDL（d=1.063-1.210g/mL）。测定分离HDL中SAA、载脂蛋白A-Ⅰ（ApoA-Ⅰ）、载脂蛋白A-Ⅱ（ApoA-Ⅱ）水平。分析HDL粒径、表面电荷、SAA和ApoA-I分布。 分离的HDL馏分用磷酸盐缓冲液（PBS）透析，4℃保存，3周内使用。除非另有说明，所有数据均代表“平均±标准偏差（SD）”。

采用SPSS20.0进行数据分析。

【结果 】

3.1 手术前后SAA水平的变化

  在PRE、POST和POD1、3和6/7时间点测定患者血浆样本（n=13）中的SAA浓度。除病例2（27.7μg/mL）外，所有患者的血浆SAA水平（平均值±标准差：5.1±2.7μg/mL）较低于PRE参考范围（<8μg/mL）。 与此相反，所有患者的血浆SAA水平在POD1（318.1±265.9μg/mL）和POD3（2552.2±1805.8μg/mL）显著升高，然后在POD6/7降低（211.9±186.1μg/mL）。 每个患者的血浆SAA在POD3达到峰值；然而，增加的幅度各不相同。 血浆HDL-C和白蛋白水平也显示出类似的趋势，与PRE相比，HDL-C和白蛋白POST分别下降了34±14%和28±12%，然后在POD3中基本保持不变。 在POD6/7，HDL-C和白蛋白水平分别下降和增加（图 1b和 1c）。

3.2 HDL载脂蛋白比值的变化

  每个HDL样品经SDS-PAGE分析后进行CBB染色（图2a）。 每个HDL组分在所有时间点都清晰地观察到2条分子量为28和8kDa的条带，分别对应ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅱ单体。在12 kDa处也观察到不同强度的条带，对应SAA。 与血浆SAA水平一致，SAA条带出现在POD1上，峰值出现在POD3上，在POD6上缺失。 与POST相比，ApoA-I条带的相对强度在POD3显著降低（提高了16.5%；p=0.013），并在POD6/7恢复；与此相反，SAA的相对含量在POD3显著增加（21.6%；p<0.001），并在POD6/7恢复到基础水平（图 2b 和 2c）。 在POD3观察到5.1%（p=0.01）的轻微下降（图2d）。

3.3 SAA增加对HDL颗粒大小的影响

  通过HPLC检查HDL颗粒大小的变化。当比较HDL组分POST和POD3时的HPLC图谱时，POD3上的保留时间略短，峰更尖锐（图3a）。 比较POD3与POST滞留时间的比值与POD3血浆SAA水平。该比值与SAA水平呈显著负相关（r=-0.611，p<0.05，n=13; 图3b）。

3.4 HDL Apoa-I分布变化

  在PRE HDL样品中，ApoA-I的大小在7.1到17.0nm之间（图4a）。较小的HDL颗粒在POD3缺失，但在POD6/7出现。HDL粒度范围从POST到POD3的下降百分比与POD3血浆SAA水平比较，其值城显著负相关（r=-0.787，p<0.005，n=13；图4b）。

3.5 HDL SAA分布的变化

  图5显示了POD3上SAA水平相对较低和较高的患者的代表性HDL图谱（图 5a和 5b）。在低SAA患者中，POD1和POD3在粒径为6.2和7.8nm处观察到2条明显的大条带（图5a）；而在高SAA患者中，与低SAA样本相比，SAA分布的范围更广（图5b）。

3.6 HDL表面电荷的变化

  用琼脂糖凝胶电泳分析HDL样品的表面电荷。在α分PRE和POST中观察到HDL颗粒；而在POD3上HDL条带的相对迁移率较其他时间点短（图6a）。 当HDL迁移的距离与POD3上的SAA水平比较时，呈显著负相关（r=-0.907，p<0.001，n=13；图6b）。

【小结】

  SAA主要由肝脏合成，是一类多基因编码的蛋白家族。SAA 在机体发生炎症反应24h内会升高。但有研究发现，在炎症状态下SAA可促进胆固醇的循环利用，动员多种细胞参与机体炎症反应与组织修复过程。有研究表明，SAA具有促进 IL-6、IL-8等多种细胞因子、黏附因子表达与释放作用。在糖尿病、类风湿性关节炎等疾病中均可见SAA高表达，提示SAA在慢性炎症状态下可能发挥重要作用。 在之前的研究中，低SAA和高SAA样品之间的HDL表面电荷存在差异。然而，这些HDL样本来自不同背景（如原发性疾病和炎症状况）的患者，因此无法控制这些差异。在本研究中，分析了其他接受骨科手术的健康患者，并观察到SAA依赖的HDL表面电荷的阳性变化。 本研究揭示了HDL中的ApoA-I快速位移、大小重塑和表面电荷的变化，这与同一个体在不同时间点的SAA水平的波动相一致。最近的研究表明，SAA影响HDL的功能，包括其抗氧化能力和胆固醇外排能力。因此， 分析SAA特异性HDL重构，可作为一种生物标志物用于HDL定性评估 。

【参考文献】 [1]ShimanoS,OhkawaR,NambuM,SasaokaM,YamazakiA,FujiiY,HoriuchiY,LaiSJ,KamedaT,IchimuraN,FujitaK,TohdaS,TozukaM.MarkedChangesinSerumAmyloidADistributionandHigh-DensityLipoproteinStructureduringAcuteInflammation.BiomedResInt.2021Jan27;2021：9241259.doi:10.1155/2021/9241259.PMID：33575357;PMCID:PMC7861920. [2]陈国良. 早发冠心病患者高密度脂蛋白（HDL）蛋白质组学研究[D].中国协和医科大学,2010. [3]王青,谢荣华,王静,赵洁.血清SAA水平变化与大动脉炎患者免疫炎症、疾病活动性的关系研究[J].解放军医药杂志,2021,33(11):60-63. 

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