科研 | Microbiome：肠道菌群调节肠道上皮P-糖蛋白以维持体内稳态平衡

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

背景：P-糖蛋白（P-gp）通过调节药物/外源性物质从肠粘膜流入肠腔，在保护肠上皮细胞方面起着关键作用。最近的研究表明，P-gp在肠粘膜屏障功能和先天免疫系统之间的相互作用中也起着关键作用。然而，十多年来，尽管人们都知道P-gp在胃肠道内环境稳定中起着核心作用，但控制其功能表达和调节的确切分子机制仍不清楚。在此，我们评估了肠道微生物组如何驱动P-gp的表达和功能。

结果：我们已经确定了肠道群落的“功能核心”微生物组，特别是梭状芽孢杆菌Clostridia和杆菌属，这对于小鼠模型中肠上皮中P-gp的诱导是必要和充分的。对这一核心微生物群落的宏基因组分析表明，短链脂肪酸和次级胆汁酸的产生与P-gp表达呈正相关。我们进一步证明，这两类微生物源性代谢物在体外和体内协同上调P-gp的表达和功能。此外，在患有溃疡性结肠炎（UC）的患者中，我们发现P-gp表达减少与上皮衍生的抗炎内源性大麻素和和管腔内容物（例如微生物或其代谢产物）的减少相结合，诱导P-gp表达的能力降低。

结论：总体而言，通过体外和体内研究以及人类受试者样本分析，我们确定了复杂微生物群落的协同功能输出与上皮成分P-gp调节之间的机制联系，其功能是抑制过度活跃的炎症，以维持肠道内稳态。因此，我们的数据支持粘膜炎症微生物组调节中的一种新的串扰范式。

论文ID

原名：Gut microbiota regulation of P-glycoprotein in the intestinal epithelium in maintenance of homeostasis

译名：肠道菌群调节肠道上皮P-糖蛋白以维持体内稳态平衡

期刊：Microbiome

IF：14.65

发表时间：2021.9.7

通讯作者：Beth A. McCormick

通讯作者单位：美国马萨诸塞大学医学院

DOI号：10.1186/s40168-021-01137-3    

实验设计

结果

        我们试图确定肠道微生物群在驱动结肠P-gp表达和胃肠稳态功能中的作用。我们首先通过广谱抗生素治疗清除传统野生型小鼠的微生物群。具体来说，在使用抗生素混合物AVNM（氨苄西林、万古霉素、新霉素和甲硝唑）治疗的第10天持续降低结肠P-gp表达和微生物负荷（图1A、D、图S1A-D）。这不是AVNM混合物的导致的，因为每种广谱抗生素链霉素或头孢哌酮也都能降低了结肠P-gp表达和肠道微生物负荷（图1B，C）。为了确定负责维持P-gp表达的微生物群落成员，我们利用每个AVNM混合物成分的特异性选择性地去除小鼠肠道微生物群的亚群。正如预期的那样，宏基因组分析显示，用万古霉素、新霉素或甲硝唑治疗传统野生型小鼠10天后，其微生物群出现扰动（图1E），而不影响总细菌负荷（图1D）。由于氨苄西林对小鼠的治疗具有广谱活性，可减少细菌负荷（图S2A），因此未进一步研究。

图1. 结肠P-gp表达需要万古霉素敏感的肠道微生物群。

        A，D WT SPF小鼠用AVNM治疗10天。图示结肠组织中P-gp蛋白表达的代表性western blot，每条泳道代表每组内的一只复制小鼠。N=每组10只小鼠，****p<0.0001，非配对t检验。B、C用链霉素（Strep）或头孢哌酮（CFP）治疗cwt-SPF小鼠7天。B P-gp蛋白表达如A所示。显示了代表性的western blot，每条泳道代表每组内的一只复制小鼠。N=6只/组，采用Dunnett多重比较检验的单因素方差分析，***p=0.0003，****p<0.0001。显示了在抗生素治疗最后一天从小鼠收集的粪便中16S DNA相对数量的C倍差异变化。数据来自两个独立实验，每组N=6，单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，****p<0.0001，**p=0.0028，基于ΔΔCt值进行统计检验。与对照组相比，在给药第10天（A，E–H）从小鼠收集的粪便中16S DNA的相对量差异为D倍。数据来自两个独立实验，每组N=10只小鼠*p=0.0178，****p<0.0001，基于ΔΔCt值，采用Dunnett多重比较试验进行单因素方差分析。D–H WT SPF小鼠用万古霉素、新霉素、甲硝唑或AVNM治疗10天。E小鼠粪便微生物群中细菌属的相对丰度。显示了两个独立实验的代表性图。N=每组5个，每个实验。F如（A，B）所示，测量 P-gp蛋白表达。将内部对照（“IC”）裂解物纳入多个印迹以进行标准化。显示了代表性的western blot，每条泳道代表每组内的一只复制小鼠。N=每组10只小鼠，采用Dunnett多重比较检验的单因素方差分析，****p<0.0001，ns p>0.05。A、 B，F密度测定数据描述了从两个独立实验收集的样本。通过对图1所示实验的测序数据进行Spearman相关检验，G细菌属与结肠P-gp表达呈正相关或负相关，显著性由P<0.05表示。H 细菌属的相对丰度与 G 中显示的结肠 P-gp 表达呈正相关。

        与新霉素或甲硝唑治疗组相比，P-gp蛋白表达显著降低（图1F）。我们确定了与这些小鼠结肠P-gp表达正相关的五个属和负相关的两个属，表明它们可能影响P-gp蛋白表达（图1G，H，表S1）。由于我们对广谱抗生素的研究结果（图1A-D）表明存在正调节P-gp表达的细菌，因此我们研究了与P-gp表达呈正相关的杆菌属和梭状芽孢杆菌属（图1G，H，表S1）。与这些观察结果一致，来自乳酸杆菌的培养上清液可以在体外诱导P-gp表达。通过抗生素治疗（例如，细胞脱落）控制肠上皮可能的形态变化，我们发现这些小鼠结肠组织中上皮标记物绒毛蛋白的表达没有改变（图S2B），这表明上皮中P-gp表达的特异性缺失。此外，抗生素在体外并未直接影响T84肠上皮细胞中的P-gp表达（图S2C）。由于这些数据表明肠道微生物群是控制结肠中P-gp表达所必需的，我们接下来检查了肠道微生物群是否也足以诱导P-gp表达。正如预期的那样，用来自野生型常规饲养的小鼠的盲肠微生物群对无菌小鼠进行定植可诱导结肠P-gp蛋白表达（图2A）。

图2. 革兰氏阳性菌群小鼠的定植足以诱导P-gp表达。

       将来自WT供体小鼠的盲肠内容物定植于WT无菌小鼠。14天后，通过western blot检测结肠组织中P-gp蛋白的表达。N=每组7-10只小鼠***p=0.0005，未配对t检验。B在C、D中显示的实验中，通过粪食重建的示意图。WT“供体”小鼠用抗生素治疗7天，然后将 AVNM 处理的 WT“受体”小鼠与来自其他各组的“供体”小鼠共饲养 7 天。C P-gp蛋白表达如A所示。显示了代表性的western blot，每条泳道代表每组内的一只复制小鼠。将内部对照（“IC”）裂解物纳入多个印迹以进行标准化。N=每组6-8只小鼠，通过单因素方差分析和Tukey多重比较检验，****p<0.0001。A、C密度测定数据描述了从两个独立实验中收集的样本。D Bray Curtis基于非计量多维标度（NMDS）的B、C组小鼠粪便微生物群排序。每个点代表一个代表性实验中的一只小鼠，处理组用颜色表示：Un_R 未处理的受体、Un_D 未处理的供体、V_R万古霉素受体、V_D 万古霉素供体、N_R 新霉素受体、N_D 新霉素供体和 AVNM。

       为了对足以诱导P-gp蛋白表达的微生物群落进行分层，我们使用抗生素处理的供体小鼠进行了微生物群落重建试验。首先使用AVNM混合物清除受体小鼠的微生物群，然后与使用单一抗生素治疗的供体小鼠共饲养（图2B）。仿照先前的研究，受体的噬粪作用是微生物组重建的一种机制。值得注意的是，经AVNM处理的受体小鼠与未经处理或经新霉素处理的供体共饲养，恢复了肠道P-gp表达，而经AVNM处理的受体小鼠与万古霉素或经AVNM处理的供体共饲养，仍然没有P-gp表达（图2C）。我们证实了受体细菌亚群与供体细菌亚群一致（图2D），这与万古霉素敏感细菌群落在体内诱导肠道P-gp表达的必要性和充分性的假设相一致。

        比较万古霉素治疗和未治疗的微生物群的宏基因组分析显示，在与结肠P-gp表达高度相关的人群中，发现了参与短链脂肪酸和次生胆汁酸产生的 Kegg Orthology（KO）群（图3A，B，数据S1）。这些微生物衍生代谢产物与肠道屏障完整性、免疫反应调节和代谢有关。丁酸是肠道中含量最丰富的短链脂肪酸之一，在癌症研究中已被证明能促进P-gp的表达。我们证明了丁酸盐的生理水平在体外诱导P-gp表达和功能，这分别通过western blot和P-gp底物罗丹明123的外流确定的（图4A-C）。相反，醋酸盐和丙酸盐对P-gp表达没有显著影响（图S3A，B）。此外，仅丁酸就足以在无菌小鼠中诱导P-gp表达（图4D）。

图3. 短链脂肪酸和次生胆汁酸产生菌与结肠P-gp表达呈正相关。

        A 火山图显示了通过western blot密度测定法在每只小鼠中相对于P-gp表达的全基因组测序数据（重组为KO组）中微生物基因相对丰度的Spearman相关试验的rho系数和相应的p值。显著性设置为p<0.05。标记了参与丁酸和次级胆汁酸代谢途径的KO。B 在A中确定的KOs与相应的酶委员会（EC）编号、定义和指示的相关途径呈正相关。

图4. 丁酸和次级胆汁酸诱导P-gp限制中性粒细胞在上皮细胞的迁移。

        A–C T84细胞与5 mM丁酸盐、50μM LCA、50μM DCA和/或50μM UDCA孵育24 h。A具有代表性的westernblot显示P-gp在裂解物中的表达。B密度测定数据描述至少两个独立实验收集的样本，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析，*p=0.0199，***p=0.0002，***p<0.0001。C在测量Rho123滞留量之前，将T84细胞按A、B处理。数据反映了Rho123荧光强度几何平均值的倒数。数据描述从至少两个独立实验中收集的样本，与DMSO对照组相比，每个样本的Dunnett多重比较试验的单因素方差分析，*p<0.05，****p<0.0001。D WT无菌小鼠口服丁酸14天。Western blot检测结肠组织中P-gp蛋白的表达。显示了代表性的western blot，每条泳道代表每组内的一只复制小鼠。密度测定数据描述了从两个独立实验收集的样本；N=每组6-7只小鼠，***p=0.0004未配对t检验。E、F WT SPF小鼠在小鼠周内给予胆苯丙胺（CME）14天。用western blot检测结肠组织（E）或盲肠组织（F）中P-gp蛋白的表达。E、 F显示代表性的western blot，每条泳道代表每组内的一只复制小鼠。密度测定显示，与不含胆胺的对照组相比。数据描述了来自两个独立实验的样本。N=每组8只小鼠。E *p=0.0237，未配对t检验。F ***p=0.0009，非配对t检验。G中性粒细胞迁移实验示意图（BioRender）。将接种在Transwell®平板底面上的T84细胞与代谢物预孵育24 h。将原代中性粒细胞添加到顶部（基底外侧）隔室，将纯化的HXA3添加到底部（顶端）隔室，并定量分析迁移穿过T84细胞单层的原代中性粒细胞的数量。H 在A–C中用丁酸盐、LCA、DCA和/或UDCA孵育接种在G中的T84细胞。定量原代中性粒细胞穿过该细胞单层迁移到顶端隔室中的HXA3。所示数据表明为单个重复井，并代表至少三个独立实验，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析，****p<0.0001，ns p>0.05。

        次级胆汁酸的抗炎活性与肠道健康相关，包括促进调节性T细胞和抑制右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎。其中最丰富的三种，石胆酸（LCA）、脱氧胆酸（DCA）和熊去氧胆酸（UDCA），对体外诱导P-gp表达和功能具有叠加性效应（图4A-C）。用消胆胺处理小鼠以阻离胆汁酸改变了结肠中的二次胆汁酸吸收，尤其是UDCA（图S4），并显著降低了盲肠和结肠中的P-gp表达（图4E，F），表明需要UDCA才能充分表达P-gp。

       尽管我们的体内研究表明丁酸或次级胆汁酸均可独立诱导P-gp表达，但每项研究均显示出相对温和的效果（图4D-F）。为了支持肠内稳态依赖于更大复杂微生物群落及其代谢产物的功能协同性的假设，体外试验显示，当暴露于丁酸和所有三种胆汁酸LCA、DCA和UDCA的组合时，T84细胞中P-gp表达的诱导能力显著增强（图4A，B）。相比之下，丁酸盐与LCA和DCA的组合，或单独与UDCA的组合，不足以观察到这种效果，这表明需要所有三种胆汁酸组合（图4A，B）。特别是，观察到的UDCA完全诱导P-gp表达的要求与我们在体内观察到的胆汁酸隔离相似（图4E，F）。此外，我们通过测量罗丹明123流出量来评估T84细胞中的P-gp功能，罗丹明123流出量在与四种代谢物（丁酸、LCA、DCA、UDCA）孵育并被P-gp选择性抑制剂PSC833阻断后达到最大值（图4C）。值得注意的是，四种代谢物组合诱导的P-gp活性也抑制了中性粒细胞在强效化学引诱剂HXA3（图4G，H）驱动下的跨上皮迁移，这一结果与细胞毒性或跨上皮阻力（TER）变化无关（图S3C，D）。

       这些发现在一组患有慢性结肠炎症的UC患者的临床样本中也得到了证实。在常规结肠镜检查程序中收集结肠组织活检、粘膜刷检和粪便样本（图5A，表S2）。从活动性疾病患者中，我们收集了结肠受累（炎症）或未受累（非炎症）区域的活检和粘膜刷片。我们观察到，与健康对照组相比，UC患者的P-gp表达显著降低，而且，与同一患者的未受影响区域相比，受影响区域的P-gp表达降低（图5B，C），这与之前的报告一致。除了4例严重/泛结肠炎患者（>1000μg/g钙卫蛋白，表S2）和假定的上皮损伤外，P-gp表达与绒毛蛋白表达无显著相关性，这也再次支持P-gp表达的特异性缺失的证据（图S5A，B）。粘膜刷毛状的脂质组学分析证实，与同一患者的未受影响区域相比，受影响区域的内源性大麻素（AEA）（P-gp分泌的抑制中性粒细胞浸润到肠腔的主要内源性大麻素）减少（图5D）。

        到目前为止，我们的数据表明，UC患者的上皮中P-gp及其内源性大麻素底物减少，表明P-gp的阳性调节因子缺失。接下来，我们试图确定管腔成分是否积极驱动P-gp表达。健康对照组（而非UC患者）的可溶性粪便组分显著诱导T84肠上皮细胞的功能性P-gp表达（图5E）。值得注意的是，高炎症患者和低炎症患者的可溶性粪便样本在P-gp诱导方面没有显著差异，这与粪便钙卫蛋白水平有关（图5E，表S2），表明UC患者粪便样本的可溶性部分，无论当前炎症状态如何，都降低了诱导结肠P-gp表达的可能性。最近的一项研究与我们的观察结果一致，发现与UC患者相比，健康对照组的梭状芽孢杆菌类成员（即毛螺旋菌科）丰富。这些科成员的功能潜力也与这些研究中确定的小鼠微生物组一致（图1E、G、H、3、表S1）。总之，这些数据增强强了我们的发现，即微生物源性短链脂肪酸和次级胆汁酸在诱导P-gp表达和功能中起着基础性作用。

图5. 人类UC肠道内容物无法维持P-gp表达。人体样本采集示意图（BioRender）。

       B人类患者结肠活检中P-gp表达的代表性western blot，显示健康对照组与UC患者，未受影响组织与受累组织，来自相同UC患者的样本用括号表示。C B组的密度测定数据，每组7-9名患者，红色方块表示3名泛结肠炎患者，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析，**p=0.0012。D棕榈酰乙醇酰胺（PEA）、油酰乙醇酰胺（OEA）和阿南达胺（AEA）20:2在人类患者的粘膜刷牙中测量。N=4名健康对照，N=7-8名UC患者，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析，**p=0.0013。体外T84细胞中人类患者粪便样本诱导的E功能性P-gp表达。将数据标准化为具有代表性的车辆控制方案；N=每组5-11名患者，单因素方差分析与Tukey多重比较，*p<0.05。

讨论

       P-gp作为肠上皮表面的一种转运体已被广泛研究，其功能是排出毒素和外源化合物，包括化疗药物。我们最近发现P-gp在输出N-酰基乙醇胺类内源性大麻素分子中发挥了新的作用，通过肠上皮的迁移抑制中性粒细胞。功能失调的P-gp与炎症性肠病（包括UC）易感性增加的相关性强调了上皮表面功能性P-gp表达的重要性，与在mdr1a-/-小鼠中观察到的自发性结肠炎的发展一致。 在此，我们确定了肠道微生物群落的一个亚群，包括梭状芽孢杆菌和杆菌类中的一个属，这是诱导结肠P-gp表达所必需的，并且足以诱导结肠P-gp表达，并通过研究抗生素清除后的抗生素扰动和重组在小鼠的微生物群中得到证实。这种细菌群落具有从膳食纤维中产生短链脂肪酸（如丁酸）和将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸的功能潜力。在一组UC患者中，我们首先证实了先前的研究显示炎症组织中P-gp表达减少，但也表明这种表达与P-gp、AEA分泌的一种原发性N-酰基乙醇胺型内源性大麻素的粘膜减少有关。此外，我们发现，健康对照组（而非UC患者）粪便样本中所含的管腔内容物具有在T84肠上皮细胞系中体外诱导P-gp表达的功能，表明这种内容物是来自健康微生物群的可溶性因子。 

       丁酸盐是三种最丰富的短链脂肪酸之一，与乙酸盐和丙酸盐一起，在健康的肠道中以毫摩尔浓度存在。重要的是，丁酸盐也是肠上皮的主要能量来源，促进结肠调节性T细胞分化，增强屏障功能。目前尚不清楚丁酸盐和P-gp是否通过相互缠绕的或独立的途径发挥作用，从而实现启动子屏障的完整性。此外，P-gp分泌的内源性大麻素可能通过上皮中的大麻素受体1（CB1）发出信号，以促进上皮屏障功能，类似类别的内源性大麻素已被报道。此外，短链脂肪酸也对包括鼠伤寒沙门氏菌在内的病原体感染的抵抗力的常驻微生物组起作用。 尽管有报道表明这可能涉及鼠伤寒沙门氏菌致病基因的直接下调，但这也可能涉及P-gp，因为在体外肠上皮细胞中P-gp的过度表达增加了对鼠伤寒沙门氏菌感染的抵抗力。 次级胆汁酸（包括LCA、DCA和UDCA）是由细菌通过生物合成酶（包括bai操纵子）转化初级胆汁酸而产生的。这些次级胆汁酸通过抑制结肠中产生IL-17的辅助性T细胞（TH17细胞），从而促进肠道内稳态，并减少化学诱导的结肠炎小鼠模型中的炎症。

       在本研究中，我们证明了三种胆汁酸LCA、DCA和UDCA能够在体外诱导P-gp的表达和功能。尤其是在试验剂量下，这些胆汁酸单独不足以达到这种效果。在各种癌症模型中，丁酸盐可诱导P-gp转录，我们观察到丁酸盐和这三种次级胆汁酸协同作用，促进功能性P-gp的最大表达。尽管确切的机制尚不清楚，但先前的研究表明至少有一种可能的途径涉及丁酸抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACi）来改变转录。此外，丁酸可激活细胞表面的G蛋白偶联受体（GPCR），或通过包括核因子相关因子2（Nrf2）在内的转录因子发出信号。次级胆汁酸可作为核受体孕烷X受体（PXR）的激动剂。激动剂激活Nrf2和PXR，可增加P-gp转录。接下来，我们提出了一个模型，通过该模型，微生物群衍生的丁酸和次级胆汁酸激活受体和信号通路，从而诱导P-gp转录，从而在存在两类微生物群衍生代谢物时放大P-gp表达（图6）。此外，P-gp进行了广泛的翻译后修饰，有助于其稳定性和活性；这些修饰是否发生在丁酸和次级胆汁酸信号的下游需要进一步研究。

图6. 微生物组驱动P-gp表达的作用模型。

        我们已经确定了一个包含杆菌和梭状芽孢杆菌类的细菌群体，足以在结肠中诱导P-gp表达。这些细菌在饮食基质中产生的丁酸和次级胆汁酸共同增强了上皮细胞上功能性P-gp表达的诱导，能够通过内源性基质内源性大麻素的流出阻止中性粒细胞迁移。我们的观察结果表明，细胞内途径会聚以扩增P-gp表达；我们提出包括以下一种或多种途径：GPCR激活、HDAC抑制、NRF2激活、PXR激活。本示意图用BioRender制作。

结论

       本研究通过诱导功能性P-gp表达，提供了健康肠道微生物群产生的代谢物与UC中性粒细胞迁移抑制之间的机制联系。我们首次展示了两类代谢物，短链脂肪酸和次生胆汁酸，它们可以协同作用以调节上皮功能。这反映了特定功能微生物组元素集合的重要性，这些功能微生物组元素相互合作，产生稳态条件所需的输出，不同于需要特定分类群的存在才能产生这种结果。最近的研究结果进一步证实了这一点，即跨不同门的细菌分类群可以贡献具有共同功能的基因。因此，我们的数据表明，培养更大的微生物群落至关重要，这可以通过已知的影响微生物组及其代谢产物生产的过程来实现。虽然膳食纤维可增加结肠中短链脂肪酸的产生，但支持结肠P-gp表达的微生物组所需的特定膳食基质足以限制过度活跃的免疫反应并维持内环境稳定，尚待确定。

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