新冠核酸检测的内源性内参---核糖核酸酶P（RNase P)

新冠核酸检测，作为新冠肺炎病人的确诊依据，引起了全社会的广泛关注。大多数医疗机构的检测方法学为RT-PCR，实验过程的质量控制要点多，技术人员的业务素质要求高，科学的曲线判读和分析处理，是保证检验结果有效性的重要保障。

案例简介

新冠核酸检测（RT-PCR），一例无任何扩增曲线（右图）。样本来源为应检尽检人员，4小时内送检，单管单采。中元提取试剂，伯杰扩增试剂。本检测批次样本92个，质控4个（1个弱阳性质控品，三个生理盐水，参与从提取到扩增的全过程）。扩增图示：

左图

右图

结果判读处理

根据基因扩增实验复检规则，无内源性内参扩增曲线，重新采集标本进行检测，同时无扩增曲线反应孔位置进行弱阳性质控的提取扩增。结果：弱阳性质控在控（左图），重采标本核酸扩增图谱有明显的“S”形内参曲线（右图）。 

左图

右图

资料查阅及思维导图

一般认为，内源性内参，对样本的采集、保存和运输以及核酸提取过程进行监控，避免假阴性结果的判读。参考伯杰扩增试剂说明书：

 《临床分子生物学检验》第三版介绍，PCR常用的内参照一般选用与待测基因序列结构无关的“管家”基因，如B-肌动蛋白（B-actin）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）等，这些基因的含量相对丰富，转录比较稳定。扩增时应在同一个反应管内进行靶基因和内参照基因的同时扩增，以尽可能避免不同反应间由于扩增效率的差异给结果带来的影响。

  综上所述，人源性内参（RNase P）扩增曲线主要受以下四个因素影响，其思维导图如下：

从上图分析，在保证提取和扩增性能指标正常的情况下，实行相同检测系统、相同操作人员的连续检测试验（样本保存实验）。结果：常温保存样本和2-8℃冷藏保存样本，28小时后内参CT值均平均减小0.9cycle。

  连续检测试验结论：28小时内，内参RNase P扩增结果基本无变化，即样本RNase P在28小时内无降解。因此，RNase P扩增曲线的缺失，与样本的保存（28小时内）无关，可以判定为标本采样不合格。

PNase P相关知识拓展

核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白，含有一个单链RNA分子，长度为375个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽。RNA具有催化切割tRNA的能力，蛋白质则起间接的作用，可能是维持RNA结构的稳定。该酶广泛存在于原核生物和真核生物中，也参与核糖体RNA的加工。

1983年，美国科罗拉多大学教授托马斯.罗伯特.切赫（Thomas Robert Cech）在研究四膜虫的rRNA的成熟体结构中，发现了可以自我拼接的RNA（即RNase P）的催化作用。他发表论文，宣布自己发现了一种本身带有催化作用的RNA。这个结论是对常识的一种否定，通常认为生物体的催化作用是依靠酶来完成的，而酶的本职是蛋白质。后来，西德尼.奥尔特曼（Sidney Altman）博士，验证了使前体tRNA变成成熟体tRNA的酶—核糖核酸酶P的切断活性是混在RNA中的，蛋白质部分没有这种活性。于是，1989年切赫和奥尔特曼一起获得诺贝尔化学奖。

目前，RNase P作为一种通用核酶，已在生命的三个王国中发现：细菌中、古菌中、真核生物中。他们的组成部分和在体内外的作用机制各不相同。古细菌和真核生物的RNase P已进化出相当复杂的蛋白亚基，但蛋白组分的作用以及蛋白组分复杂性增加的原因仍然是未知的。在之后的研究中陆续发现，细菌和真核的RNase P RNA有相同的起源祖先，但是却沿着不同的进化道路有了分化：真核的RNase P RNA在没有蛋白的存在的时候是不具有催化功能的，细菌的RNA则相反——没有蛋白也同样可以催化底物。通过比较这两种不同的RNA，研究人员逐渐清楚了解了这个RNA和蛋白结合世界的转换，他们发现虽然真核生物RNAs不能单独催化底物，但是即使在没有蛋白的存在下，也可以折叠成有功能的形式，并结合到tRNA上去。

细菌、古菌和真核RNase P复合物进化模型

2018年上海交通大学雷鸣团队在《Cell》发文：《Cryo-EM structure of the human Ribonuclease P holoenzyme》，第一次揭示了高分辨率的人源RNase P全酶的电镜结构：酿酒酵母RNase P全酶是一个具有催化作用的RNA（即Rpr1）和9个蛋白组分构成。Rpr1 RNA采取一种延伸的单层构像，蛋白组分紧紧围绕在Rpr1 RNA的周围，从而将酵母RNase P稳定为一种“测量设备”。另外本文详细阐述了人源关键核酶RNase P催化tRNA前体加工成熟的分子机制。

酿酒酵母RNase P全酶模型

雷鸣团队揭示酵母tRNA前体被 RNase P催化切割

由此我们可以认为，在远古时期，主要是核酶发挥功能，蛋白酶后来者居上，逐渐取代或者部分取代了核酶的功能。此消彼长，核酶的功能被消弱，而蛋白的功能得以增强，强者越强，也就造就了现代的蛋白世界。不过核酶的核心区域依然没有被剥夺，制造蛋白质的机器，依然是RNA在掌舵。

PNase P研究进展

研究一：应用人胎肝细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

研究抗组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)核糖核酸酶P(RNaseP)抑制肝细胞表面MHCⅡ分子的表达。

结论 ：抗CⅡTA RNaseP—M1—629—GS可发展为新一代抗肝移植排斥的核酸药物。

研究二：应用Daudi细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

中国互联网企业100强榜单主要参考互联网企业年度发展数据，评价指标既覆盖收入、利润、人力资本等财务指标，也覆盖流量、活跃用户数等业务指标。

结论 ：抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达。

研究三：应用Jurkat细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

探讨抗MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达.

结论:抗CⅡTA的M1-RNA(M1-3408-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。