丘脑室旁核谷氨酸能神经元参与艾司氯胺酮麻醉觉醒作用机制研究

空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科，西安 710032

国家自然科学基金（81620108012，82071554）；

国家重点研发计划（2017YFC1308402）

【论著】

本研究通过钙信号光纤记录、在体光遗传及化学遗传技术探究丘脑室旁核（PVT）核团谷氨酸能神经元在艾司氯胺酮麻醉觉醒中的作用，为艾司氯胺酮麻醉的神经环路机制提供理论依据。

研究全部选择8~10周龄雄性Vglut2‑cre转基因小鼠。取3只小鼠在PVT区立体定位注射钙信号病毒rAAV‑ EF1α‑DIO‑GCaMp6s‑WPRE‑hGH pA，3周后采用钙信号光纤记录技术观察艾司氯胺酮麻醉前后PVT谷氨酸能神经元的活性变化。取10只小鼠采用随机数字表法分为光遗传激活组（ChR2组）和光遗传对照病毒组（mCherry1组），每组5只，分别在PVT区立体定位注射兴奋性光遗传学病毒rAAV‑EF1α‑DIO‑hChR2（H134R）‑mCherry‑WPRE‑hGH pA或对照病毒rAAV‑EF1a‑ mCherry‑WPRE‑hGH pA，并埋置刺激光纤，3周后采用光遗传学技术激活PVT谷氨酸能神经元，观察麻醉维持期mCherry1组和ChR2组脑电频谱及各频段百分比总功率变化。取16只小鼠采用随机数字表法分为化学遗传抑制组（hM4Di组）和化学遗传对照病毒组（mCherry2组），每组8只，分别在PVT区立体定位注射抑制性化学遗传病毒rAAV‑EF1α‑DIO‑hM4D（Gi）‑mCherry‑ WPREs pA或对照病毒，3周后采用化学遗传学技术抑制PVT谷氨酸能神经元，观察mCherry2组和hM4Di组诱导时间和觉醒时间的变化。

2.1　PVT谷氨酸能神经元钙信号变化

与清醒基线（−0.002 7±0.022 3）比较：PVT谷氨酸能神经元钙信号在麻醉诱导期（0.154 8±0.075 0）明显增加（P<0.05），持续300~500 s；在麻醉期，钙信号（−0.168 6±0.061 8）明显下降（P<0.05）。小鼠RORR后钙信号（−0.134 9±0.065 2），与麻醉期比较差异无统计学意义（P>0.05），但其低于清醒基线水平（P<0.05）。见图1

2.2　光遗传激活PVT谷氨酸能神经元对氯胺酮麻醉皮质脑电的影响

与刺激前比较，ChR2组刺激中δ频段百分比总功率明显下降［（44.7±5.4）%比（29.6±6.7）%］（P<0.05），α频段百分比总功率明显增加［（7.0±1.0）%比（10.5±1.5%）］（P<0.05），其他频段的百分比总功率有上升趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.3　化学遗传抑制PVT区谷氨酸能神经元对艾司氯胺酮麻醉诱导时间和觉醒时间的影响

荧光验证结果显示病毒表达良好且注射位点准确。与mCherry2组比较，hM4Di组觉醒时间延长［（2 364±272） s比（2 875±396） s］（P<0.01），但hM4Di组和mCherry2组麻醉诱导时间比较差异无统计学意义［（78±17） s比（73±23） s］（P>0.05）。见图4。

本研究首先通过钙信号光纤记录技术发现，腹腔注射麻醉剂量（100 mg/kg）艾司氯胺酮后PVT谷氨酸能神经元活性变化表现为先升高、再下降，与异氟醚、丙泊酚麻醉下PVT神经元活性逐渐下降不完全一致，该现象可能与艾司氯胺酮独特的分子作用机制有关。

本研究通过光遗传兴奋PVT谷氨酸神经元及化学遗传抑制PVT谷氨酸神经元证实了该神经元在艾司氯胺酮麻醉诱导、维持和觉醒中的作用。光遗传激活PVT谷氨酸能神经元可以显著降低δ频段的百分比总功率，增加α频段的百分比总功率，脑电发生觉醒样改变；而化学遗传抑制该神经元则显著延长艾司氯胺酮麻醉维持时间、推迟觉醒时间。关于本研究中调控PVT谷氨酸能神经元并未改变艾司氯胺酮麻醉诱导时间，可能是由于艾司氯胺酮起效快、诱导迅速，而本实验采用翻正反射评价诱导时间的敏感性过低导致的。这也提示我们，如何评价如艾司氯胺酮等具有快速诱导作用的静脉麻醉药诱导效应的差异，还需要探索更加敏感的行为学评估方法。

艾司氯胺酮作为一种分离麻醉药，麻醉效应及作用机制独特。本研究通过钙信号光纤记录、光遗传学及化学遗传学调控等多种方法初步验证了PVT核团谷氨酸能神经元在艾司氯胺酮麻醉过程中的活性变化及调控作用，为艾司氯胺酮麻醉神经环路机制提供了证据。进一步研究其他睡眠觉醒相关或麻醉相关神经网络在艾司氯胺酮麻醉中的作用，有助于深入理解全身麻醉引起意识消失的神经机制，为新型麻醉药开发及临床精准用药提供指导。

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