科研 | MICROBIOME：阻断细菌FimH可预防与克罗恩病相关的粘膜炎症

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

背景：一种具有侵袭性病理类型的大肠杆菌（E.coil）首次被Darfeuille-Michaud报道，称为粘附性侵袭性大肠杆菌 (AIEC)，结果表明，在克罗恩病（CD）患者中，有多达一半的人感染了这种细菌，这表明这些细菌可能参与了CD的病理生理学过程。在与AIEC致病性相关的基因中，fim有可能产生来自肠上皮细胞和巨噬细胞的炎症反应，因为它与TLR4相互作用，诱导独立于LPS的炎症细胞因子的产生。因此，靶向表达FimH的细菌的细菌粘附似乎是一种很有前途的治疗方法，包括在不杀死细菌的情况下解除细菌的武装，这是一种选择性策略，可以在不干扰肠道微生物群的情况下抑制肠内炎症的潜在关键触发因素。

结果：我们分析了来自两个不同队列的358例CD患者肠道微生物组的宏基因组组成，并鉴定了存在表达FimH的细菌。为了评估FimH的致病作用，我们使用人类肠道外植体，并测试了一种特定的FimH阻滞剂，以防止细菌粘附和相关的炎症。我们观察到CD患者肠道微生物组中肠杆菌科的显著和疾病活动依赖性的富集。在65%的CD患者的回肠活检中，细菌FimH的表达在功能上得到证实。使用人类肠道外植体，我们进一步证明FimH对于粘附和触发炎症是必不可少的。最后，一种特殊的FimH阻滞剂TAK-018可抑制细菌粘附到肠上皮上，防止炎症，从而保持粘膜完整性。

结论：我们认为TAK-018在人类中安全且耐受性良好，是治疗CD的有希望的候选药物，特别是在预防CD复发方面。

论文ID

原名：Blockage of bacterial FimH prevents mucosal infammation associated with Crohn’s disease

译名：阻断细菌FimH可预防与克罗恩病相关的粘膜炎症

期刊：Microbiome

IF：14.65

发表时间：2021.8.23

通讯作者：Grégoire Chevalier

通讯作者单位：法国巴黎莱德鲁罗林大道94-96号

DOI号：10.1186/s40168-021-01135-5  

实验设计

结果

1. 研究参与者的特征

我们使用鸟枪宏基因组测序法对401名个体的肠道微生物群落进行了评估，其中包括358名CD患者（来自2个不同的队列）和43名健康志愿者（HV）。使用鸟枪测序法对收集的所有样本进行分析，并对不同细菌种类的读数进行量化，同时相对于粪便总DNA进行归一化，以便对所研究的不同细菌DNA种类进行无偏量化。

补充表1中描述了每项研究的人口统计学数据、CD病史和疾病活动。补充表2中给出了HV的人口统计学数据。对来自CrohnOmeter研究的第一组CD患者进行纵向随访，我们没有观察到不同时间点的HBI（补充图1a）和大肠杆菌相对丰度的统计上的显著性差异（补充图1b）。因此，我们选择将分析重点放在与第一个可用时间点对应的数据上，以便将该队列与PREDICT研究中的第二个队列进行比较。

  2. CD患者表现出以肠杆菌科细菌大量繁殖为特征的微生物群改变

正如预期的那样，与HV患者样本相比，在这两个患者队列中，根据Shannon多样性和Simpson多样性指数测量的整体α多样性在CD患者样本显著降低（图1a，b）。通过β多样性分析证实了CD患者的微生物群的特异性，并通过Bray-Curtis相异度证明了根据CD诊断对两个同质性相同的队列进行的样本聚类（图1c）。我们还观察到队列1和队列2在Shannon多样性和Simpson多样性指数（图1a，b）以及Bray–Curtis相异度（图1c）方面存在显著差异，可能是因为2个队列之间患者的孕期状态，如队列2中较高的Harvey-Bradshaw指数和较高的钙卫蛋白水平所示（补充表1）。测定大肠杆菌和其他肠杆菌科细菌的相对丰度，我们观察到与HV相比，肠杆菌科细菌在CD患者体内迅速富集：事实上，30%至55%的样本显示不同的肠杆菌科细菌，包括志贺菌、肺炎克雷伯菌、肠沙门氏菌和大肠杆菌，增加了10倍以上（图2a、b和补充表3），说明在CD中观察到的肠杆菌科的大量繁殖（与HV中的平均丰度相比，CD患者中观察到的肠杆菌科物种数量增加了10倍）。此外，在PCoA分析中，我们观察到队列2患者在PC1评分中的不同聚类（图1c）。事实上，一些患者样本与HV聚集在一起，但更大的部分与健康对照组非常不同（补充图3A）。队列2中患者样本的这种二分法已被进一步调查肠杆菌科细菌的丰度水平，我们观察到了显著的差异，与第2组其他患者相比，第2组患者群体在PCoA上与HV重叠的肠杆菌科丰度显著降低（补充图3B）。就相对丰度而言，占HV中所有粪便细菌DNA不到0.02%的大肠杆菌，成为所有大于20%的CD患者样本的主要物种，占所有粪便DNA 1-80%。接下来，我们根据供体的疾病状态分离样本（HBI>4时考虑处于疾病活动期，HBI≤4时考虑处于安静期） 并观察到肠杆菌科水平与疾病活动之间的关联（图2c，d）。

图1 来自2个不同队列的CD患者的微生物群改变。a、 b使用α多样性：Shannon（a）和Simpson指数（b）计算CD患者和健康志愿者的物种多样性。c根据队列1、队列2和HV的Bray–Curtis相异度主坐标分析（PCoA）指标显示微生物聚类。椭球表示每组周围95%的置信区间。队列1中有74例CD患者，队列2中有284例CD患者，以及43名健康志愿者。条形表示所有点的中间值。非参数Mann–Whitney U检验用于确定各组之间的统计显著性差异 (*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，****P<0.0001）。

图2 CD患者的粪便微生物组成以肠杆菌科细菌的大量繁殖为特征。a、 b：（a）是在队列1中的CD患者中大量繁殖的物种和（b）在队列2中，与HV的平均相对丰度相比，CD患者中快速繁殖的物种的平均相对丰度增加了10倍。仅代表队列1或队列2中至少有20%的患者在激增的物种。注意前5个物种中存在4个肠杆菌科。c：队列1和队列2的HV和CD患者中肠杆菌科的相对丰度。d：队列1和队列2中的HV、活动期和静止期CD患者中肠杆菌科的相对丰度。当HBI>4时，CD患者被认为处于疾病的活动期，当HBI≤4时，处于静止期。条形代表所有点的中间值。非参数Mann–Whitney U检验用于确定各组之间的统计显著性差异 (*P<0.05，***P<0.0005，***P<0.0001）

3. CD患者回肠活检中的细菌表达FimH粘附素  

在宏基因组水平上，我们证实FimH的存在仅限于一个蛋白细菌家族，即表达FimH的肠杆菌科所有物种（补充图2）。我们还测试了MOBIDIC研究中第三组CD患者回肠活检中是否存在表达FimH的细菌（补充表1）。为了做到这一点，我们使用我们设计的双甘露糖基化化合物TAK-018（EB8018/Sibofmloc）敏感地识别FimH表达（补充图4）。我们发现TAK-018聚集了涉及表达FimH的粘附性侵袭性大肠杆菌LF82株，而一株FimH阴性的大肠杆菌LF82突变株与TAK-018孵育后未聚集，允许用TAK-018检测表达测FimH的细菌（图3a）。我们观察到，65%的患者（69/106名患者）确实表现出由表达FimH的细菌组成的粘附菌落，通过聚集至TAK-018进行测量（图3b）。我们通过测序，共分离出98株大肠杆菌菌株被称为“粘附性侵袭性大肠杆菌”来描述了FimH与“粘附性侵袭性大肠杆菌”表型之间的关系（补充表4）。我们将测序数据与聚集试验的结果相关联，并针对大肠杆菌LF82菌株用作参考菌株，特异性聚焦于fim操纵子。针对fimS区域的映射揭示了“开启”位置的读取百分比（指示整个fim操纵子的表达）与TAK-018的聚集之间存在强烈关联（补充图5）。当应用于CD患者的样本时，我们还观察到通过qPCR分析的粪便中fimS水平与这些样本回肠活检中FimH的功能性表达之间存在密切关系（图3c）。

图3 CD患者回肠活检中的细菌能表达FimH粘附素，并以TLR4依赖性方式诱导炎症反应。a. E. coli LF82与TAK-018孵育后的发生聚集。注意，FimH−/−LF82 E. coli与其他大肠杆菌孵育后未发生聚集，这表明聚集是一种依赖于FimH的现象。b. 通过回肠活检中细菌聚集到TAK-018来测量CD患者中是否存在表达FimH的细菌。对每位患者进行一到两次活检分析。c. 通过qPCR测定CD患者粪便样本中表达的FimS-ON。条形表示所有点的中间值。非参数Mann–Whitney U检验用于确定各组之间的统计显著性差异（*P<0.05；n.s. 不显著）。d.  HEK-hTLR4+/+和HEK-TLR4−/−与FimH一起孵育，并随着FimH浓度增加，促进了TNF-α分泌。LPS以100 ng/ml的浓度作为阳性对照。FimH在酵母中产生，以获得无脂多糖。数据以0处的平均值为中心。条形图表示所有点的平均值。采用协方差分析 (ANCOVA) 确定FimH处理后TLR4−/−和TLR4+/+组之间有统计学意义（****P<0.0001；0nM和LPS条件排除在ANCOVA之外）。

4. FimH阻滞剂TAK-018以TLR4依赖性方式防止肠杆菌科细菌在肠道外植体中粘附和侵入

FimH被描述为肠道中一种有效的TLR4激动剂，可独立于脂多糖（LPS）的存在而触发炎症，即使CD患者回肠活检中TLR4表达上调。如前所述，我们证实，在与纯化的FimH孵育后，由人类胚胎肾（HEK）上皮细胞分泌的肿瘤坏死因子α（TNFα）的呈剂量依赖性增加，该FimH在TLR4−/−HEK细胞中被完全屏蔽（图3d）。考虑到在CD患者回肠活组织检查中，TLR4的表达被未成熟的细胞因子上调，并且未成熟的环境有利于肠杆菌科的大量繁殖，我们假设FimH作为导致CD恶性循环的促成熟触发器起着关键作用，强调设计能够破坏这种致病循环的治疗策略的重要性。

因此，我们通过对粘附性侵袭性大肠杆菌和非粘附性侵袭性大肠杆菌与上皮细胞的粘附试验，研究了TAK-018阻断细菌粘附素FimH的效果。我们观察到不同的细菌被描述为粘附性侵袭性大肠杆菌（最显著的是E. coli LF82）能够以FimH依赖的方式粘附于人原代肠道细胞，除了41CB2菌株不表达FimH（图4a和补充表4）。此外，我们证明了TAK-018在细菌粘附方面的浓度呈依赖性降低，在1 µM TAK-018下观察到所有菌株的具有完全阻断活性（图4a），在T84上皮细胞系上也证实了这一点（补充图6）和原代回肠细胞（补充图7）。这种细菌粘附的阻断进一步阻止了E. coli LF82对上皮细胞的细胞内感染（图4b）。

我们还测定了TLR4和TAK-018对细胞因子分泌的影响。E. coli LF82诱导TNFα、IL-6和IL-8的强烈分泌，TAK-018剂量依赖性地抑制所有三种细胞因子的分泌，1 µM的保留水平接近或低于基础水平（图4c和补充图8）。通过测定T84细胞的跨上皮电阻（TEER），我们进一步评估了紧密连接动力学和肠道通透性方面的功能影响。大肠杆菌LF82以FimH依赖的方式诱导TEER显著降低；作为一个FimH缺失的LF82突变体，它不影响TEER。这些效应由TAK-018剂量依赖性地抵消，并1 µM时具有完全的剂量依赖性（图4d）。同样，用E. coli LF82对肠组织表现出极其明显的炎症反应，粘膜脱落（图4e）。随着TAK-018用量的增加，培养再次显示，初始反应逐渐减少，肠道外植体完整性普遍明显改善，浓度为1 µM的TAK-018能够保持正常组织完整性（图4e）。

 图4. FimH阻滞剂TAK-018可防止肠杆菌科粘附和肠道外植体侵入。a. 不同大肠杆菌在TAK-018浓度增加的情况下，大肠杆菌感染人类原代肠上皮细胞。注意，41CB2菌株不表达FimH。条形代表单个点的平均值，这些点本身对应于生物复制。对各组进行方差分析，以确定TAK-018（***P<0.001）的统计显著性影响。b. 在TAK-018浓度增加的情况下，人回肠外植体上皮细胞与E. coli LF82 孵育后细胞内菌落数。条形代表各个点的平均值，它们自身对应于生物复制。进行方差分析以确定TAK-018的统计显著性影响（*P<0.05）。c. 人回肠外植体与浓度为109E. coli LF82 中培养4h后分泌TNF-α。在TAK-018浓度增加的情况下，使用IL-1β作为阳性对照来触发诱导。条形代表单个点的平均值，这些点本身对应于生物复制。Wilcoxon有符号秩检验确定LF82和LF82+TAK-018 1 µM组之间的统计显著性差异（P=0.031）。线性混合模型用于确定LF82、LF82+500 nM和LF82+1 µM组之间的统计显著差异（P=0.07）。d. 在TAK-018浓度增加的情况下，T84细胞与浓度为109大肠杆菌 LF82孵育4h后跨上皮电阻（TEER）的变化。注意，FimH−/−LF82大肠杆菌不会粘附至T84细胞，因此不影响TEER。条形代表单个点的平均值，这些点本身对应于生物复制。采用非参数Kruskal–Wallis检验确定LF82组之间的统计显著差异（P=0.02）。e. 大肠杆菌LF82的组织病理学效应。在TAK-018浓度增加的情况下，CD患者回肠外植体上的大肠杆菌粘附和相应的反作用。注意大肠杆菌LF82培养4小时后的特征性粘膜脱落，并在TAK-018浓度增加时明显减少。

讨论

本研究记录了CD患者肠道中的大肠杆菌和其他肠杆菌科细菌。我们的数据表明，大量表达FimH的细菌可能参与CD患者的发病。纵向随访时，我们观察到超过75%的CD患者肠杆菌科存在潜在致病水平。在人类回肠切除术中，FimH有助于粘液定植，减少粘液厚度、上皮粘附和浸润以及脱落。此外，在结肠炎的动物模型中，FimH被证明能诱导严重的炎症损伤，由于FimH的基因缺失导致FimH突变株LF82 AIEC灌胃后的植入和诱导较少。AIECs的发病机制与fim操纵子的过度表达有关。粘附性侵袭性大肠杆菌的发病机制与fim操纵子的过度表达有关。这里报道的临床队列显示，与CD和疾病活动相关的表达FimH的细菌数量增加，这些细菌数量占前4名。基因fimH受到可逆fimS启动子“开关”机制的严格控制。qPCR策略是使用引物设计的，引物可以扩增粪便样本中fimS的水平。结果表明，粪便中的fimS与聚集性有统计学联系。在回肠活组织检查中，这表明这可能是一种可靠的无创性工具，用于诊断CD宿主FimH表达细菌的患者。然而，我们没有对粪便样本进行宏基因组分析，也无法推断粘附性侵袭性大肠杆菌水平是否与粪便和回肠样本相关。迄今为止，在人类肠道细菌中，只有FimH蛋白，特别是大肠杆菌FimH蛋白在UniProt数据库上用基因本体术语“甘露糖结合”（GO:0005537）进行注释。据我们所知，肠杆菌科中没有其他能够识别甘露糖的基因。这些细菌通过其fimH与肠道内对LPS不敏感的TLR4受体相互作用，诱导TNFα大量释放。fimH基因在非炎性条件下不构成组成表达，因此，这些共生体对宿主无害。一旦形成生物膜，表达FimH的细菌就可以通过上皮细胞的跨细胞作用，侵入粘膜以及也被派尔斑中的M细胞吞噬。

在耐药细菌病原体的当前状态下，有效治疗患者的抗生素的可用性是有限的，甚至可以通过杀死有益细菌和允许耐药物种过度生长而进一步加剧生态失调。CD的传统疗法和新疗法包括生物制剂，这些生物制剂针对婴儿期途径中的各种作用机制，但它们并不针对来源于不平衡的肠道微生物群以及促孕病原菌的导致的炎症。因此，从肠道清除携带细菌的致病性FimH代表了一种选择性策略，以抑制肠道内营养不良的潜在关键触发因素。

我们已经证明，使用表达FimH的粘附性侵袭性大肠杆菌参考菌株LF82，靶向FimH可以防止细菌粘附并减轻回肠外植体中的感染。考虑到肠杆菌科的所有成员都表达FimH，我们假设该策略也适用于其他肠杆菌科物种。然而，我们没有在动物模型中测试我们的FimH阻滞剂，而是根据这些结果选择进入临床实验。尽管如此，我们的数据表明FimH是CD的初始触发因素，CD患者Ib期临床研究（NCT03709628）的启动将带来预期的信息，即FimH阻断是否代表治疗CD患者的现实策略。针对表达FimH的细菌的细菌粘附是一种很有前景的治疗方法，包括在不杀死细菌的情况下“解除”细菌，这是一种选择性策略，可抑制肠道内炎症的潜在关键触发因素，而不会干扰肠道菌群。此外，与其他抗菌剂相比，这种治疗方法施加的选择压力较弱，所以预计细菌耐药性的出现是残余的。因此，为了干扰粘附性侵袭性大肠杆菌与宿主细胞的粘附，开发合理设计的药物，并通过模仿其天然配体使FimH的碳水化合物识别域（CRD）饱和。这也激发了研究者对采用更好的个性化治疗策略来治疗CD患者的兴趣。

结论

考虑到其他疗法的局限性，TAK-018被设计作为一种新型、第一类小分子FimH受体阻滞剂，通过口服给药，由于肠道限制，全身吸收最少。我们在此表明，CD患者的微生物群富含Enterobacteriaceae spp，这种富集在活动性CD患者中更为明显。由于肠杆菌科表达细菌粘附素FimH，我们也证实CD患者回肠活检中存在细菌FimH表达，揭示了CD患者中表达FimH的细菌具有病理生理作用。利用人类肠道外植体，我们进一步证明了FimH对于粘附和触发炎症是必不可少的。最后，一种特殊的FimH阻滞剂TAK-018被证明能以剂量依赖性的方式减少细菌粘附，完全减弱炎症反应并保持组织完整性。此外，我们还进行了为期2周的Ia期临床研究，其中TAK-018在最大日剂量为3000 mg/天的健康志愿者中表现出良好的耐受性（NCT02998190）。TAK-018的风险平衡使CD患者能够启动Ib期临床研究，以评估TAK-018指定的药代动力学（NCT03709628）。由于其性质和作用方式，TAK-018在维持治疗中非常有效果，并与其他更多这种症状的疗法相辅相成。因此，在II期研究中，TAK-018在术后CD患者中进行了评估。