初步研究揭示人类粪便微生物组的组成变化与偶氮还原活性的关系

2021
11/26

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微生态
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点击蓝字↑↑↑“微生态”,轻松关注不迷路 生科云网址:https://www.bioincloud.tech 编译:微科盟大头虾,编辑:微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

背景:通过微生物酶库,肠道菌群在很大程度上促进了人体代谢过程,影响营养物质、药物和环境毒素。偶氮还原酶(Azoreductases)是一种主要的微生物源酶,参与外源代谢和药物激活,但目前我们对肠道菌群组成变化与其偶氮还原活性之间的关系知之甚少。

结果:为此,我们使用高通量16S rRNA扩增子测序,结合Illumina MiSeq,确定了16个不同偶氮还原活性的成人粪便样本的微生物群落组成。高偶氮还原活性与厚壁菌门Firmicutes (特别是链球菌Streptococcus 和粪球菌属Coprococcus)的相对丰度呈正相关,而与拟杆菌门Bacteroidetes (特别是拟杆菌属Bacteroides) 的相对丰度呈负相关。Firmicutes/Bacteroidetes之间以及Prevotella/Bacteroides之间的比率在样品间存在典型的差异。关键微生物类群的相对丰度和其他多样性参数的多变量分析证实厚壁菌门 (Firmicutes) 的比率是区分高偶氮还原菌和非偶氮还原菌的主要变量,而拟杆菌门 (Bacteroidetes) 的相对丰度与偶氮还原菌、性别和BMI相关。

结论:本初步研究显示,Firmicutes富集于具有较高偶氮还原活性的粪便样本中,而Bacteroidetes相对较少。但需要更多来自不同地理区域的样本和研究来支持这一结论。对不同产生偶氮还原酶的肠道微生物进行更好的表征,将增加我们对含偶氮还原酶药物或口服化学品的命运和人类不同反应的知识,从而有助于在精准医学和毒理学中实施微生物组检测。

 

论文

名:Compositional variation of the human fecal microbiome in relation to azo-reducing activity: a pilot study

一项初步研究揭示人类粪便微生物组的组成变化与偶氮还原活性的关系

期刊Gut Pathogens 

IF:4.181

发表时间:2021.10.8

通讯作者:Ramy K. Aziz

通讯作者单位:埃及开罗大学药学院微生物与免疫学系

DOI号:10.1186/s13099-021-00454-0

实验设计

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实验设计图     表3 收集粪便样本的志愿者元数据。  

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a正常体重范围:18.5-24.9,超重范围:25-29.9,肥胖:30或以上。

 

结果

1 粪便样品总脱色活性

  16个粪便标本中有6个在实验时间内 (10 h) 亮黑水平没有明显下降,属于0级脱色组。另外2个样品具有中等偶氮还原活性 (在实验的10 h中只导致部分脱色) ,脱色电位分为0级和1级 (图S1)。后8个样品具有更高的偶氮还原活性 (在实验时间内导致完全或接近完全脱色),并被划分为2级类别 (表1和图S1)。

表1 新鲜粪便样品对0.06 M亮黑的偶氮还原活性。

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实验结束时,根据染料脱色的完整性和脱色率,将样品分为0、1、2等3个等级。

2 微生物分析

  从16个粪便样本中提取的DNA的高通量测序产生了2,579,071个reads (平均=161,012.5 reads /样本)。质量评估和配对reads连接筛选出2,520,799个reads (平均每个样本reads=157,670.50) 用于分析。稀释曲线(Rarefaction curves)确认了合理的覆盖度,足以分析细菌群落的优势成员和样品之间的比较,所有样品的观察到的reads数 (121,509) 稀疏度无限接近最小值。

3 微生物组剖面和肠道微生物组生物标志物比率

  在门水平上,共鉴定出11个不同的门,其中有4个门在所有的样品中体现出最高的丰度,包括:拟杆菌门Bacteroidetes (相对丰度范围为40.3 ~ 66.1%,平均值为50.19%)、厚壁菌门Firmicutes (相对丰度范围为29.2 ~ 54.7%,平均值为41.65%)、变形菌门Proteobacteria (相对丰度范围为1.1 ~ 14.1%,均值=4.87%)和放线菌门Actinobacteria (相对丰度范围:0 ~ 5.4%,均值=1.12%)。而其他7个门的比率较低,且未鉴定的细菌序列的相对丰度在0.005到0.053%之间 (图1A)。

  在属水平上,共观察到174个属,其中36个属 (占总微生物群落的88.13%) 为所有样品共有,可视为“核心属(core genera)”。17个属 (代表整个群落的0.007%) 每个样本都有一个独特的属 (称为单属) ,而其他121个属,存在于一些但不是所有的样本 (非核心属) ,代表整个群落的3.95% (图1B)。评估常用的肠道微生物组生物标志物。Firmicutes/Bacteroidetes的比率为0.45 ~ 1.3 (平均值=0.87);Prevotella/Bacteroides的比率为0.000067 ~ 1.36 (平均值=0.15);Fusobacterium/Bifdobacterium的比率仅在6个可检测到梭杆菌Fusobacterium序列的样品中测量到,范围为0.001 ~ 0.5 (表2)。

 

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图1 在门水平(A)和属水平(B)的粪便样本中检测到的微生物群落分类总结。在所有样本中,只有40个平均相对丰度最高的属被显示出来。

 

表2 在分析的粪便样本中选择肠道微生物组生物标志物。

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Prevotella/Bacteroides的比率>1使用粗下划线标记出来,Fusobacterium/Bifdobacterium的比率>0使用细下划线标记出来。

  4 与偶氮还原活性相关的关键类群以及肠道微生物组生物标志物的相对丰度组成变化

  根据拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和厚壁菌门 (Firmicutes) 的偶氮还原活性 (或缺乏偶氮还原活性) 的程度,不同样品的拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和厚壁菌门 (Firmicutes) 的相对丰度存在显著差异 (Kruskal Wallis 检验,p值<0.05,图2A)。由于Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度各自对所观察到的偶氮还原酶活性有显著但相互关联的影响,因此Firmicutes/Bacteroidetes的比率在不同等级之间存在显著差异 (Kruskal Wallis检验,p值=0.0161,图2C)。此外,样本间Prevotella/Bacteroides的比率差异较大,0级样本的中位数最低 (比例为0.00072或1:1394),1级 (比例为0.00388或1:58) 和2级 (比例为0.00706或1:142)。

  尽管存在这些显著差异 (图 S2),但由于“2级”样本的双峰分布 (图2C) 结果没有达到统计学意义:Prevotella/Bacteroides比率较高的样本位于高降解菌中,但并不是所有高降解菌的比例都很高。在门水平上,样本组成的层次聚类突出了上述Bacteroidetes和Firmicutes相对丰度的反比关系(图S3)。在较低的分类水平上,追踪到Bacteroidetes和Firmicutes在不同偶氮还原活性等级间的相对丰度差异显著。在科水平上,拟杆菌目Bacteroidales下的8个科中,只有拟杆菌科Bacteroidaceae在3个等级间的相对丰度存在显著差异 (Kruskal-Wallis检验,p值=0.0106)。

  Bacteroides作为Bacteroidaceae中唯一的代表菌株,相对丰度在3个等级中差异显著 (Kruskal Wallis检验,p值=0.015) (图3A),其中非降解样品的相对丰度最高 (中位数为0.4409) 。在Firmicutes的不同科中,只有链球菌科Streptococcaceae在3组间存在显著差异 (Kruskal Wallis检验,p值=0.0127)。最后,在属水平上,隶属于Streptococcaceae的链球菌属Streptococcus和属于毛螺菌科Lachnospiraceae的粪球菌属Coprococcus的组间相对丰度差异显著 (Kruskal Wallis检验,p值分别为0.0146和0.0089,图3B)。虽然在门水平上,各类群的相对丰度差异不显著 (图2B),但放线菌门Actinobacteria和变形菌门Proteobacteria在3个等级中有一些科和属的相对丰度差异显著,包括:棒状杆菌科Corynebacteriaceae (本质上是棒状杆菌属Corynebacerium,Kruskal Wallis检验,p值=0.0302),变形菌属Lautropia (伯克氏菌科Burkholderiaceae) 和副球菌属Paracoccus (红杆菌科Rhodobacteraceae),(Kruskal Wallis检验,p值=0.0302)。在属水平上,样品组成的层次聚类表明,在可检测偶氮还原活性的样品 (1级和2级样品) 中,Coprococcus, Ruminococcus, Blautia和Adlercreutzia相对丰度较高。而另一方面,Bacteroides在非降解样品中更丰富 (图4)。

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图2 Bean/Violin图表示不同偶氮还原活性等级粪便样本中核心门 (A和B) 和肠道微生物组生物标志物 (C) 的相对丰度。在门水平上,A和B因尺度不同而分开。经Kruskal Wallis检验的显著差异p值 (p<0.05) 显示在每个版块上方,还指出了事后两两检验中显著差异的p值。

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图3 Bean/Violin图表示不同偶氮还原活性等级组间拟杆菌门Bacteroidetes (A) 和厚壁菌门Firmicutes (B) 不同属的相对丰度,经Kruskal-Wallis检验和事后两两检验评估的p值有显著差异 (p<0.05)。

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图4

  在属水平的肠道菌群组成的层次聚类的可视化热图。样品根据不同的标准进行分类,并根据其偶氮还原活性进行排列。热图上方的颜色代表样本所属的偶氮还原活性、受试者性别和受试者BMI类别。热图颜色 (蓝色到深红色) 显示了所有样本中每个分类单元的行比率相对丰度。聚类基于欧氏距离。 

5 α和β多样性分析

  如果不能在性别和BMI组之间发现其存在差异 (图S4和S5),则常见的α多样性指标均不显著,而样品的偶氮还原活性等级显著影响其多样性,但对丰富度没有影响 (图5)。而样本组间多样性分析 (β多样性) 并未显示出明显的聚类模式。

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图5

  不同偶氮还原活性等级之间的α多样性指标 (使用OTUs、Chao1、Shannon和Simpson多样性指数进行观察) 的箱线图。通过Kruskal-Wallis检验估计显著差异,然后进行非参数事后两两检验,p值<0.05。

  6 多变量分析

  由于样本量小,且研究对象之间存在BMI差异,我们使用线性模型进行了多变量分析,以估计每个测量变量对物种多样性指标和相对丰度差异的贡献程度。具体来说,我们试图验证Firmicutes、Bacteroidetes和α多样性之间的变化是否真的与样品的偶氮还原活性有关,还是由于混杂因素,如BMI (表S1)。偶氮还原活性与Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度显著相关 (p值分别为0.0081和0.0007)。而Bacteroidetes相对丰度受性别和BMI的影响显著 (p值分别为0.0087和0.0451)。另一方面,年龄和BMI均与Actinobacteria丰度显著相关 (p值分别为0.0148和0.0215,表S1)。同样地,一项基于相同的4个协变量与肠道生物标志物比值的多变量分析中,筛选出Firmicutes/Bacteroidetes的比率可作为一个具有偶氮还原活性的显著协变量 (p值=0.0045,表S2)。偶氮还原活性、年龄、性别和BMI与多样性指数的多变量分析表明,偶氮还原活性、性别和BMI对样本丰富度没有显著贡献,而年龄仅与Chao1丰富度指数具有显著的协变量。同时,多变量分析也证实了Simpson多样性指数是偶氮还原度的预测因子 (p值=0.0329,表S3)。

讨论

  人类肠道含有数万亿个代谢活性微生物细胞,这些细胞用数百万个基因及其编码的酶丰富了人类基因库。偶氮还原酶 (Azoreductases,由人类肠道菌群的几个成员表达) 极大地影响偶氮的代谢,广泛用于食品和制药。肠道微生物群组成预计会影响许多药物和含有偶氮染料的化合物的代谢。在不考虑肠道菌群组成的情况下,将这些含偶氮药物/外源性药物应用于不同人群,可能会影响这些药物的代谢和生物利用度。在这项研究中,为了减少饮食和生活方式的差异,我们从同一个社区收集了16份粪便样本,并使用16S rRNA扩增子测序对其核心微生物群进行了定义。该分析是公认的小样本量,旨在以一个试点比较分析的微生物组结构,联系肠道微生物群落的整体偶氮还原活性。尽管在过去的几年里微生物组研究大量涌现,但在埃及进行的肠道微生物组研究很少,而且没有一项研究关注于外源性化合物降解表型。

  早期的微生物组研究报告称,厚壁菌门 (Firmicutes) 和拟杆菌门 (Bacteroidetes) 在肠道中占主导地位 (相对丰度约为90%),但程度差异很大,同时很多学者认为Firmicutes/Bacteroidetes的比率是人类肠道菌群状态的重要生物标志物。因为Firmicutes和Bacteroidetes在肠道中共存意味着资源竞争最小化。肠道微生物群状态/健康的另一个重要生物标志物是Prevotella/Bacteroides的比率,这被认为是成功减脂的预测指标,特别是在高纤维和全谷物饮食中。在我们的研究中,粪便样品的微生物组特征具有典型的肠道微生物组特征,Firmicutes和Bacteroidetes占微生物种群的92%。该研究的一个重要发现是,高偶氮还原活性与Firmicutes正相关,而与Bacteroidetes负相关。这可能是因为Firmicutes的基因组中含有丰富的偶氮还原酶编码基因。然而,Proteobacteria取代Firmicutes成为偶氮还原酶的产生菌;可是,在不同的粪便样本中,它们的相对丰度并没有显著或一致的变化,这可能是由于它们在肠道菌群中的总体相对丰度低于Firmicutes和Bacteroidetes。因此,高偶氮还原粪便样品比低或未降解粪便样品具有更高的Firmicutes/Bacteroidetes的中位数比率。

  此外,Prevotella/Bacteroides的中位数比率在高偶氮还原组较高,但由于组内变异性高,未达到统计学意义。尽管一些Bacteroides菌株以其偶氮还原活性而闻名,而Prevotella菌株中由于没有偶氮还原酶,可能在一些高偶氮还原样品中相对富集。因为它与Bacteroides呈负相关,而实际的活性是取决于这些样品中Frimicutes的成员。通常情况下,当Bacteroides在样本中含量高时,Prevotella含量低,反之亦然。对于Prevotella在偶氮还原剂中相对丰度的高变异性的另一种解释,可能是在某些Prevotella菌株中尚未发现偶氮还原酶活性,或者该活性具有特异性,因此不能通过16S rRNA分析解决。

  在属水平上,α多样性的Simpson多样性指数存在显著差异,但丰富度差异并不显著。这一结果表明,类群的区别在于其均匀性,而不是数量。根据偶氮还原活性分类样本 (并通过UniFrac加权方法估计) 的β多样性表明,他们没有特定的聚类模式。一种可能的解释是:虽然Frimicutes似乎对最终偶氮还原酶活性有明显的影响,但不同的Frimicutes属在不同的样品中占优势,没有观察到特定的分类群;然而,这些属的存在似乎可以编码足够的偶氮还原酶。Fusobacterium/Bifdobacterium的比率被认为是肠道微生物群失调的一个生物标志物。据报道,结直肠癌患者Bifdobacterium的相对丰度降低,同时伴之以柔嫩梭菌Faecalibacterium prausnitzii丰度增加。不出所料,在这项研究中,Faecalibacterium菌株在10个样本中为0,而在其他6个样本中可忽略不计,可能原因是我们所有的样本都是从没有报告疾病的受试者中收集的 (除了一个受试者肥胖以外) 。

  最后,我们对不同细菌类群和肠道微生物组生物标志物的相对丰度与参与者的年龄、性别和BMI进行了多变量分析,以排除观察到的相关性是由混杂因素引起的。不变的是,偶氮还原活性被发现是Firmicutes相对丰度的关键因素,也是与Bacteroidetes相对丰度的显著协变量之一,从而影响Firmicutes/Bacteroidetes比率。另一方面,BMI是Bacteroidetes和Actinobacteria的关键协变量。这些结果和Kim等人报道的放线菌门与体重呈正相关结论保持一致。此外,一项对瘦双胞胎和肥胖双胞胎的肠道微生物群的调查发现,肥胖受试者中Actinobacteria的水平较高。Kim等也报道了年龄显著增加了Actinobacteria门中的Coriobacteriia 纲和红蝽菌科Coriobacteriaceae的比率,而La-ongkham等人观察到,成人受试者中Actinobacteria的相对丰度明显比老年人高约2.3倍。在此,我们证明了年龄与Chao 1丰度和Actinobacteria相对丰度具有显著的协变量关系,但与其他3个主要门的协变量关系不显著。

  结论

  总之,本文在一项初步研究中分析了16名埃及成年志愿者的粪便微生物群落,以将微生物群落组成与其偶氮还原活性联系起来。我们观察到与人类肠道环境相关的主要类群,并揭示了典型的肠道微生物群特征。尽管本研究样本量小,但采用多变量+单变量分析表明有统计学意义的趋势显著。菌群的增殖表明,不同还原级别样品的Firmicutes/Bacteroidetes和Prevotella/Bacteroides的比率存在差异,证明Firmicutes的相对丰度可能是影响最终还原氮活性的最显著因素。此外,不同偶氮还原等级的样品均匀度差异较大。本研究的主要限制是小样本量和缺乏因果关系背后观察统计关联的证据。

未来的研究应该通过:

1) 分析更大的队列;

2) 通过组合和比较来自不同地理位置、代表不同饮食和生活方式的不同人群的样本

3) 使用动物模型或肠道微生物群的离体模型来研究因果关系 (例如,通过实验改变Firmicutes/Bacteroidetes的比率和测量偶氮还原酶活性) 等方式来解决这些局限性。

此外,鸟枪宏基因组学、宏蛋白质组学、代谢组学和功能性宏基因组学策略都可能为微生物群参与氮还原过程的机制的洞察提供证据。此外,本研究的结果突出了表征偶氮还原酶产生的肠道细菌的重要性,尤其是拟杆菌门Bacteroides和普雷沃氏菌Prevotella,这些细菌还没有像厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria那样被研究过,它们可能有重要的菌株水平变化。这些研究将有助于增加我们对含偶氮染料的药物或化学品的命运,以及人类对它们的不同反应的知识。这些结果还将指导更有效的药物和剂型的开发,并将有助于在精确医学和毒理学中实施微生物组检测。


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关键词:
厚壁菌门,微生物群,肠道菌群,微生物,偶氮,粪便

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