科研 | JEM：新鲜的有机肥是将存活的微生物引入土壤还是激活了土壤中的土传微生物群?

编译：微科盟达达兔，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

施有机肥对土壤的微生物群落影响很大，导致微生物多样性和活性发生改变。目前还不清楚这些影响的原因主要是由有机肥引入的存活微生物还是因为施肥激活了土壤中的土传微生物群落。本文主要研究新鲜有机肥引入后土壤微生物群落的变化，以及有机肥中的微生物在土壤中存活的情况。施用有机肥导致土壤微生物生物量、基因拷贝丰度、呼吸活性和多样性的显著增加。高通量测序分析表明，施用有机肥的土壤微生物多样性较高的主要原因是激活了113个土传微生物属，这些微生物属大多是未施肥土壤中的小类群。施用有机肥2周后，78%与有机肥相关的属没有再被检测到。有机肥引入的237个原核属中，只有15个在土壤中存活了144d，其中只有8个属(以梭菌属Clostridia为代表)在冬季后的土壤中存活。所以，施用有机肥后微生物生物量和多样性增加的主要原因是土壤土传微生物群落的激活，而大多数来自有机肥的外源微生物在几个月后就无法在土壤条件下存活。

论文ID

原名：Does fresh farmyard manure introduce surviving microbes into soil or activate soil-borne microbiota?

译名：新鲜的有机肥是将存活的微生物引入土壤还是激活了土壤中的土传微生物群?

期刊：Journal of Environmental Management

IF：6.789

发表时间：2021.6.16

通讯作者：Mikhail V. Semenov

通讯作者单位：莫斯科多库恰耶夫土壤研究所

DOI号：10.1016/j.jenvman.2021.113018

试验设计

结果

1. 牛粪有机肥的微生物群落组成

有机肥中古菌的丰度为每克干物质9.6±0.8×109基因拷贝数，细菌丰度为每克干物质2.5±0.25×1011基因拷贝数，真菌丰度为每克干物质2.1±0.2×109基因拷贝数(图1)。细菌基因转录拷贝数(每克干物质3.6±0.36×109拷贝数)比基因拷贝数低70倍。牛粪有机肥中总计237个原核属(25纲，隶属17门)，66个真菌属(4门，16纲)被检测到(图1)。放线菌门(DNA中占13.2%，RNA中占4.3%)，拟杆菌门(15.8%；13.6%)，厚壁菌门(48.0%；54.1%)和变形菌门(15.2%；26.5%)是有机肥原核生物群落中的四个优势门(图1和图5)。有机肥群落中，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌的相对丰度高(DNA中占61.2%，RNA中占58.3%)。以下三类占RNA所有指定核苷酸序列的58%：梭状芽孢杆菌属(Clostridia)占47.4%，γ变形菌属(Gammaproteobacteria)占26.2%，拟杆菌(Bacterodia)占13.6%。不动杆菌属(Acinetobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、红皮杆菌属(Erysipelothrix)、发酵单胞菌属(Fermntmonas)和疣微菌属(Ruminococcaceaea UCG-005)在整个(DNA)原核生物群落中是优势属(图1和图6)。不动杆菌属(Acinetobacter)(21.5%)和疣微菌属(Ruminococcaceaea UCG-005) (17.6%)在(RNA)原核生物群落中占绝对优势(图1和图6)。子囊菌门(Ascomycota) (86.5%)和担子菌门(Basidiomycota) (11.5%)是有机肥真菌群落中的优势菌门。念珠菌属(Candida)占33.4%，嗜热真菌属(Thermomyces)占10.2%，短梗霉属(Aureobasidium)占5.8%，单胞酿酒酵母属(Kazachstania)占5.4%，木霉属(Trichoderma)占4.8%(图1)。

有机肥微生物群落包含许多共生和潜在的致病属。共生属中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia) (0.8%)、拟杆菌属(Bacteroides) (1.2%)、双歧杆菌属(Bifidobacteria) (0.2%)、棒状杆菌属(Corynebacterium) (9.7%)以及普雷沃氏菌科(Prevotellaceae) (6.2%)和疣微菌科(Ruminococcaceae) (6.2%)均得到鉴定。潜在的人类和动物致病属相对丰度较高的是：Acetitomaculum，不动杆菌属(Acinetobacter)，梭状芽胞杆菌(Clostridioides)，人费克蓝姆菌(Facklamia)，黄杆菌属(Flavonifractor)，寡养杆菌属(Oligella)和泰氏菌属(Tissierella)。此外，还发现了3个后生古菌属：甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)，甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)和甲烷菌属(Methanosphaera)。

 图1. 使用的新鲜有机肥的化学性质和微生物组组成。在属水平上，列出了微生物群落中前25个原核和真菌属的相对丰度。

2. 土壤性质、微生物生物量C与基础呼吸

施肥土壤的总有机碳、全氮、碳氮比(表1S)显著高于未施肥土壤(p<0.001)。长期施用有机肥后，土壤总有机碳含量从1.0%增加到1.6%，全氮含量从0.11增加到0.16%，碳氮比从9.1增加到10.4(表1S)。施用有机肥并没有改变土壤pH值，2种处理的pH值均为6.1。

从4月到10月的5次采样中，未施肥土壤的微生物碳(MBC)和基础呼吸(BR)都是稳定的(图2a和b)。施肥前，施肥土壤的(MBC)和(BR)是未施肥土壤的2.7倍。施用有机肥后，第二次测定，MBC提高了2.1倍，BR提高了2.5倍。MBC和BR逐渐降低(130d后MBC降低1.3倍，BR降低1.6倍)，直到10月(图2a和b)。

 图2. (A)土壤微生物生物量碳(MBC)、基础呼吸(BR)、细菌(C)、古菌(D)、细菌转录(E)和真菌基因拷贝数(F)的时间动态。第133d RNA的基因转录未被测定。横轴表示从第一次抽样(4月22日)开始的天数。有机肥输入时间为5月20日，试验开始后28d，第二次取样前14d。

3. 利用RT-PCR估算土壤微生物基因拷贝丰度

古生菌的丰度从每克土壤1.63×109基因拷贝数到每克土壤1.96×109基因拷贝数，细菌的丰度从每克土壤7.34×109基因拷贝数到每克土壤6.36×109基因拷贝数。和MBC和BR不同，未施肥的土壤中所有被考虑到的微生物基因拷贝数均以时间变化为特征(图2c，d，e，f)。施肥土壤的细菌基因转录拷贝数是未施肥土壤的6.2倍。有机肥的大量投入(1.8-2.0倍)增加了原核基因数量和基因转录拷贝数的丰度。真菌对施肥的响应较慢，其丰度仅在第三个采样期(施肥后50d)增加(图2f)。

  4. 土壤微生物的α多样性

除了10月份之外。施肥土壤微生物群落的Shannon指数高于未施肥土壤(图3a)。同时，长期施有机肥对土壤微生物群落的Shannon指数没有影响。与Shannon指数规律不同的是：在施肥前，未施肥和施过肥的土壤中检测到的属数相同(190-195)。在施肥后，发现的属数量急剧增加，7月份最高达到272个属。施肥土壤中检测到的属数下降到初始值(图3b)。

图3. (A) Shannon指数和(B)属数的时间动态。横轴表示从第一次抽样(4月22日)开始的天数。肥料输入5月10日，试验开始18d后。

  5. 土壤和有机肥的β多样性

基于Bray-Curtis和PERMANOVA检验，将土壤和有机肥微生物群落划分为6个不同的类群(图2S)。结果表明，群落聚类沿目标类型(未施肥土壤、施肥土壤、有机肥)和群落代谢状态(总/活性)两个轴向分布(图2S)。施肥土壤的原核生物群落位于未施肥土壤和有机肥群落之间。采样时间对土壤原核生物群落结构没有显著影响。

  6. 土壤微生物群落结构与组成

在土壤中共鉴定出730个属(106纲，隶属于44个原核门)。在730个属中，三次采样期间只发现383个。酸杆菌门(Acidobacteria)，变形菌门(Verrucomicrobia)和疣微菌门(Verrucomicrobia)是总(DNA)原核生物群落中最丰富的三个门(图3S)。三组原核生物门对有机肥的输入有响应(p<0.01)：1) 对施肥反应积极的富养生物(厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、纤维杆菌门Fibrobacteres和广古菌门Euryarchaeota)；2)因施肥而数量减少的寡养菌装甲菌门(Armatimonadetes)，蓝藻门(Cyanobacteria)，疣微菌门(Verrucomicrobia)，奇古菌门(Thaumarchaeota)，绿弯菌门(Chloroflexi)，酸杆菌门(Acidobacteria)，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)；3)无论是否施肥，硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和浮霉菌门(Planctomycetes)都占有一定的群落份额(图3S；表2S)。在纲的水平上，大多数类群根据它们所属的门的行为对有机肥作出反应(图4；表2S)。但是，有机肥的投入增加了梭状芽孢杆菌门(Clostridia)的份额，降低了杆菌门(Bacilli)的份额，这2种都属于厚壁菌门(Firmicutes)。在古菌类群中，施肥激活了土壤中的甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和甲烷微菌纲(Methanobacteria)，而亚硝基菌纲(Nitrososphaeria)相对丰度降低。

对相同样本的总(DNA)群落数据与代谢活性(RNA)群落数据进行比较(图3S)。在代谢活性菌群中，厚壁菌门(Firmicutes)，蓝藻门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和变形菌门(Proteobacteria)的比例高于总菌群，而疣微菌门(Verrucomicrobia)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)的比例较低(图3S)。施肥两周后，施肥土壤中厚壁菌门(Firmicutes)含量较高，随后逐渐下降。 

在属水平上，以下3个属代表了未施肥土壤中所有指定的核苷酸序列的43%：暂定种占23%，RB-41占15%，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)占5%(图4S)。优势属还包括单胞菌属(Arenimonas)、苔藓杆菌属(Bryobacter)、Candidatus Solibacter、衣单胞菌属Chthonomonas、Massilia (图6；图4S)。与未施肥土壤相比，施用有机肥土壤中Candidatus Udaeobacter、Candidatus Solibacter)、衣单胞菌属(Chthonomonas)和RB-41减少了2到3倍。施用有机肥土壤中最具代表性的属是：酸杆菌属(Acidibacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、慢生根瘤菌属(Slow yrhizobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、溶杆菌属(Lysobacter)、藤黄色单胞菌属(Luteimonas)、MND1、丰佑菌属(Opitutus)和假单胞菌属(Pseudomonas)(图6)。

在属的水平上具有代谢活性的原核生物群落与总群落相比存在很多差异(图5)。在RNA的数据中，主要优势菌群Candidatus Udaeobacter、RB-41和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度非常小(小于1%)(图5)。相反，很多在DNA中丰度低的属却是代谢活性微生物群落的优势属。在施肥土壤的代谢活性类群中，一些源自有机肥的属也占主导地位：Candidatus Udaeobacter、拟杆菌属(Bacteroides)、不动杆菌属(Acinetobacter)、疣微菌属(Ruminococcaceae UCG-005)和疣微菌属(Ruminococcaceae UCG-010)(图5)。

图4. 土壤总(DNA)的结构和活性(RNA)，有机肥在纲水平上的原核生物群落(数据显示丰度超过0.3%的纲)。土壤和有机肥的测定指标如下(1)S-未施肥土壤，MS-施肥土壤，M-新鲜有机肥；(2)采样时间(从1到5)；R-基于RNA数据的群落结构。革兰氏阳性菌(除阴性菌门外的放线菌门和厚壁菌门)在总菌群和活性菌群中的相对丰度分别为62.8%和56.5%。杆菌门(Bacilli)和梭状芽胞杆菌(Clostridia)是革兰氏阳性菌类，对有机肥微生物群贡献最大。

 图5. 在属水平上，处理前30个微生物类群(DNA)和活性(RNA)原核生物群落的相对丰度(N = 3)。数据以z分数的形式给出。z值为正的微生物属丰度用橙色表示，z值为负的微生物属丰度用蓝色表示。土壤和粪肥指标如下：(1) S-未施肥土、MS-施肥土、M-鲜有机肥；(2)采样时间(从1到5)；基于RNA数据的R-群落结构。

图6. 施肥土壤中3个属的时间动态取决于它们对肥料输入的响应。至少3个采样周期，微生物属的相对丰度大于0.1%。绿条表示土壤中存活的有机肥微生物属的数量。红色条形图表明施用有机肥后土壤微生物属的活性(在施用有机肥土壤中发现，未施用有机肥的土壤和有机肥中未发现/在三个采样周期中丰度至少增加了1.5倍)。绿条表示对有机肥输入没有反应的微生物属。横轴表示施肥后的周数。

  7. 有机肥微生物在土壤中的存活及其激活土传微生物群落情况

为了分析土壤中有机肥微生物的存活情况和土壤微生物群落的激活情况，我们采用3个采样周期内相对丰度大于0.1%以上的微生物属(图6)。施肥2周后，与有机肥相关的78%(157/201)的属没有再被检测到(图6)。另外11个属在施肥8周后未检测到，7个属在施肥14周后未检测到。在最后一次取样(10月，有机肥输入20周后)中，只有14个属(7%)来自有机肥。冬天过后，15个属中有7个属未被检测到(图5S)，施肥土壤中仅有8个与有机肥相关的属存活(图5S)。所有与有机肥相关的属的丰度随时间呈下降趋势(图7e和f)。

总的来说，在未施肥的土壤、施肥的土壤和有机肥中共同发现了5个属，戴沃斯氏菌属(Devosia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、细杆菌属(Microbacterium)、小梨形菌属(Pirellula)和假单胞菌属(Pseudomonas) (图4S)。与此相反，未施肥和有机肥土壤中共鉴定出150个属，而未施肥土壤中仅鉴定出63个属。施肥土壤微生物多样性较高的主要原因是激活了113个土传微生物属，这些微生物属在未施肥土壤中大多是次要类群，所以没有被发现。施肥2周后，检测到了80个被激活的属出现在微生物群落中，其相对丰度至少增加了2倍(图6；表6S)。施肥6周后(加入8周后)鉴定出102个被激活的属。被激活的属的数量随时间的延长而逐渐减少，10月份，施肥20周后发现被激活的属有74个(表6S)。但是，在冬季之后的有机肥土壤中只鉴定出58个属(图6；表5S)。图7表明了在未施肥土壤中，几种丰富度高的土传微生物属具有稳定的丰度(图7a和b)，但是对有机肥的引入有积极的反应(图7c和d)。反应最迅速的分类是藤黄色单胞菌属(Luteimonas)，在总群落中从0.22%增加到3.58%，在激活的群落中从0.40%增加到3.54%(图7c和d)。施用有机肥后溶杆菌属(Lysobacter)丰度从0.55%增加到1.29%(图7c和d)。

图7. 几种土壤和肥料微生物属对肥料输入的响应。A)未施肥土壤中总(DNA)土传微生物；B)未施肥土壤中活性(RNA)土传微生物；C)有机肥输入激活的土壤微生物总量(DNA)；D)有机肥输入的土壤微生物活性(RNA)；E)有机肥引入的总(DNA)微生物；E)有机肥引入的活性(RNA)微生物。

讨论

1 新鲜有机肥菌群以革兰氏阳性菌为主

前人的研究大多数集中在有机肥微生物群落中个体代表的生态学上，主要是人类病原体，比如大肠杆菌(Escherichia)或沙门氏菌(Salmonella)，这些都是革兰氏阴性菌。本研究中，在有机肥群落里，革兰氏阴性菌的2个优势种类是拟杆菌纲(Bacteroidia)和γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)。这些群组是典型的富养生物。研究表明，在有机肥中革兰氏阳性菌占主导地位。当环境条件不利时(比如水分不足、温度过高或过低)内孢子可以使芽胞杆菌属(Bacilli)和梭菌属(Clostridium)长期休眠。当环境条件有利时，内孢子可以重新激活自己，使菌落恢复到营养状态。放线菌菌丝可以适应适应高温、高盐和缺乏水分的条件。

牛肠道里的细菌群落主要以梭菌纲(Clostridia)，杆菌纲(Bacilli)(多为革兰氏阳性)，拟杆菌纲(Bacteroidia)和γ变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)(多为革兰氏阴性)为主。牛饲料对牛肠道的微生物组成有显著影响。在用饲草喂养的牛中，肠道微生物群多样性较高，厚壁菌门(Firmicutes)丰度较高，拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度较低。当喂牛的饲料从高饲料向高精料过渡后，牛肠道里的微生物群落多样性降低。

本试验采用玉米、大麦麦秸和混合草料组成的普通饲粮。和牛的肠道群落相比，牛粪里有机肥的微生物群落组成大多数是依赖于排便前最后几周所消耗的饲料。特别是饲料里纤维和氮的含量决定了微生物群落的组成。大部分情况下厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacterioidetes)是优势菌群，但是当饲料的主要成分是未加工的玉米粒时，变形菌纲(Proteobacteria)也比较常见。此外，抗生素等杀菌剂和草甘膦等除草剂也会影响肠道和有机肥的微生物群落组成。

  2 新鲜牛粪有机肥的微生物群落组成揭示抗生素、高饲料和淀粉饲料的使用

新鲜牛粪有机肥的微生物群落的多样性很高，有很多系统发育和生态群组，包括古细菌产甲烷生物、共生细菌或潜在的人和动物病原体。其中有一些微生物群组可以作为奶牛生活条件的指标—饮食和抗生素的使用。本研究中，被激活的有机肥微生物群组中最丰富的属是不动杆菌属(Acinetobacter)(21.5%)。世界卫生组织有关“优先病原体”的数据显示，不动杆菌菌株对现代多种抗生素具有极强的耐药性。这种细菌可以寻找新的方法来抵抗抗生素的治疗，而且能传递遗传物质，使其他细菌也具有耐药性。所以，牛粪有机肥里的微生物组中不动杆菌属的丰度较高和长期试验农场对奶牛频繁使用抗生素的情况是一致的。

本研究也鉴定了与牛饲料密切相关的微生物属：dgA-11肠道组，毛螺菌科(Lachnospiraceae）NK3A20，甲烷短杆菌科(Methanobrevibacter)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和疣微菌科(Ruminococcaceae UCG-005)。长期使用高抗性淀粉饲料喂养猪，猪的肠道中就存在dgA-11肠道组。疣微菌科(Ruminococcaceae UCG-005)，毛螺菌科(Lachnospiraceae）和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)也与苜蓿草料饲料有关。瘤胃中最丰富的甲烷产生菌属是甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)。所以，用高饲料喂养产生的甲烷比用高谷物喂养产生的含量高，而且瘤胃中用高饲料喂养比用高谷物喂养的甲烷短杆菌科(Methanobrevibacter)的丰度高。因此，我们可以检测到抗生素的使用情况，而且可以区分出高饲料和淀粉饲料的新鲜牛粪有机肥的微生物群落组成。

3 大多数有机肥微生物无法在土壤中生存

施用有机肥后，土壤微生物生物量、基因丰度、多样性和呼吸活性均有显著提高。但施用有机肥2周后，大部分土壤微生物特性均呈下降趋势。较不敏感的微生物特性(真菌丰度和微生物多样性)在第9周后开始下降。绝大多数与有机肥相关的微生物，特别是革兰氏阴性菌，在土壤条件下几乎立即死亡，只有少数的属在几个月后可以在土壤中存活。所有存活的微生物几乎都是革兰氏阳性梭状芽胞杆菌属(Gram-positive clostridia)或是和它们的系统发育关系相近的细菌群落，这些都可以形成内生孢子。令人意外的是，在土壤环境中有机肥微生物群组中的芽孢杆菌和放线菌没有存活下来。 

本研究表明，土壤可以有效的缓冲外来微生物，比如病原体。由于前人的研究只考虑了施肥土壤中的微生物群落，没有对肥料本身的微生物群落进行分析，所以目前还没有研究它的主导机制。但是，最重要的因素可能是土壤比肠道更具有好氧的条件，所以导致氧敏感属的微生物消失。此外，肠道微生物的竞争性腐生能力在土壤中可能受到限制。土壤和掠食性群落中，碳源利用的局限性也影响到了外源微生物在土壤环境中的生存。最后，细菌从一个生态位移动到另一个生态位(特别是在有利条件下的土壤微生态位)，这个过程主要依靠降雨。本试验中，在施肥前后和取样期间至少7d没有降雨，这可能阻碍了微生物从有机肥中转移到土壤，也许是土壤外源性微生物群落存活较低的原因。虽然土壤可以有效的减少微生物污染，但是Acenitobacter的较高丰度表明抗生素的抗性基因转移到土壤上还存在问题。施用的有机肥中有残留抗生素和肠道耐药基因有助于增强环境中的水平基因转移。在有机肥微生物水平基因转移时，接合作用(细菌细胞间遗传物质的直接交换)的贡献可能不重要，在抗生素抗性基因向土壤微生物的水平转移时，遗传转化(细菌从其环境中吸收遗传物质的能力)可能会发挥关键作用。

  4. 施用新鲜有机肥可激活土壤中的土传微生物群

施用有机肥增加了土壤有机碳和氮含量，微生物生物量和丰度，微生物多样性和呼吸活性。施用有机肥对土壤微生物群落的主要影响是激活了土壤中113个原核生物属。施用有机肥8周后这种效果最好，然后随着时间的增加这种效果逐渐消失。1年以后，和未施肥的土壤相比，施肥土壤中仍有58个被激活的微生物属。本研究证实了之前的结果，即有机肥改变了土壤微生物的结构，增加了原核生物的丰富度。因此，施用有机肥对土壤微生物群落具有长期影响。但是，这种效应的持续时间很大程度上取决于施用肥料的剂量，以及施用肥料的时间期限。施用家禽粪肥3年内的效果不明显。在微观试验中，施肥对未处理农田土壤细菌群落的影响较小，这主要是由于原本土壤微生物群落的稳定性。

施用新鲜有机肥激活了很多原来的土壤微生物群落中代表性不足的微生物类群，增加了微生物的多样性。微生物多样性是影响土壤系统可持续功能的因素之一，土壤对植物病原菌的抑制活性也和微生物的多样性密切相关。有机耕作方式下的微生物类群的网络连通性和丰度均高于传统耕作方式。有机肥也可以作为植物病原体拮抗剂的替代碳源。在本研究中，施用有机肥显著增加了植物病原菌拮抗物的丰度，比如Collimonas和溶杆菌属(Lysobacter)。所以，经过适当处理的不含致病性微生物的有机肥是有机基质和养分的有效来源，可以激活很多土传微生物，增加土壤微生物的多样性。

评论

通过研究施用新鲜有机肥后土壤微生物群落的变化，以及有机肥中的微生物在土壤中存活的情况，旨在验证施用有机肥后土壤微生物生物量和多样性的增加的主要原因，是因为施用有机肥的微生物存活还是因为土传微生物群落的激活。结果表明，施用有机肥显著增加了土壤微生物生物量、基因拷贝丰度、呼吸活性和多样性。高通量测序分析表明，施用有机肥的土壤微生物多样性较高，主要原因是激活了113个土传微生物属，这些微生物属大多是未施肥土壤中的小类群。所以，有机肥改变了土壤微生物的结构，增加了原核生物的丰富度。因此，施用有机肥对土壤微生物群落具有长期影响。但是，这种效应的持续时间很大程度上取决于施用肥料的剂量，以及施用肥料的时间期限。经过适当处理的不含致病性微生物的有机肥是有机基质和养分的有效来源，可以激活很多土传微生物，增加土壤微生物的多样性。